分子生物学第九章DNA重组技术

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1、第　九　章DNA重组技术对多数生物来说，基因本质是DNA，基因工程就是要改建DNA，涉及DNA序列的重新组合和建造，所以基因工程的核心就是人工的DNA重组（重组、建造的DNA分子只有纯化繁殖才有意义。纯的无性繁殖系统称为克隆。纯化繁殖DNA就称为DNA克隆或分子克隆，基因的纯化繁殖就称为基因克隆。所以DNA重组和分子克隆是与基因工程密切不可分的，是基因工程技术的核心和主要组成部分。重组DNA、分子克隆甚至成了基因工程的代名词。基因工程属于生物技术范畴，广义的生物技术指任何利用活的生物体或其一部分生产产品或改良生物品质的技术；狭义的生物技术是

2、专指以DNA重组技术和单克隆技术为标志发展起来的新技术。一般认为这新的生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程几方面的内容。基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术；细胞技术是生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件；发酵工程是生物技术获得最终产品的手段，四个方面相互联系的。生物技术是一个综合技术体系，其中基因工程和细胞融合技术最为突出。蛋白质工程则是在基因工程基础上综合蛋白质化学、蛋白质晶体学、计算机学辅助设计等知识和技术发展起来的研究新领域，开创了按人类意愿设计和研制人类需要的蛋白质的新时期，被称为第二代基因工程。第一节　工具酶

3、一、限制性核酸内切酶的概念核酸酶可分为两类：核酸外切酶是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶,能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶,最常见的是甲基化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化,从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制一修饰体系,其功能就是保护自身的DNA,分解外来的DNA,

4、以保护和维持自身遗传信息的稳定。二、限制性核酸内切酶的命名按酶的来源的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。三、限制性核酸内切酶的分类按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ类限制性核酸内切酶　由3种不同亚基构成，兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识别和结

5、合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点以外的DNA序列，通常在识别位点周围400-700bp。这类酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。Ⅱ类限制性核酸内切酶 与Ⅰ类酶相似，是多亚蛋白质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要ATP供给能量。Ⅲ类限制性核酸内切酶　只由一条肽链构成，仅需Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言。四、限制性核酸内切

6、酶的作用大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征，切断的双链DNA都产生5’磷酸基和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同，结果有三种不同的情况：①产生3’突出粘性末端（cohesiveend）:以Eoor为例：5’…G↓AATTC…3’→5’…GpOHTTAAC…3’3’…CATAA↑G…5’EooPⅠ3'…　 CTTAAOHpG…5'②产生5’突出的粘性末端：以PstⅠ为例：5’…CTGCA↓G…3’→5’…CTGCApOHG…3’3’…G↑ACGTC…5’PstⅠ3’…GOHpACGTC…5③产生平末端（

7、bluntend）:NruⅠ为例：5’…TCG↓CGA…3’→5’…TCGpOHCGA…3’3’…AGC↑GCT…5’NruⅠ3’…AGCOhpGCT…5’DNA重组技术中最常用的工具酶酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切断DNA链DNA聚合酶Ⅰ或其大片段（Klenow）①缺口平移制作标记DNA探针②合成cDNA的第二链　③填补双链DNA3’凹端　④DNA序列分析耐热DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶聚合酶链反应（PCR）DNA连接酶连接两个DNA分子或片段多核苷酸激酶催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端标记探针末端转移酶在3

8、’末端加入同质多聚物尾SI核酸酶，绿豆核酸酶降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端DNA端酶Ⅰ降解DNA，在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解除RNA磷酸酶切除核