分子生物学研究方法--重组DNA技术

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1、第五章分子生物学研究方法简介第一节重组DNA技术一、重组DNA技术相关概念（一）DNA克隆克隆（clone）：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。克隆化（cloning）：获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。分子克隆（DNA克隆）细胞克隆个体克隆（动物或植物）DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的DNA与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。又称基因克隆或重组DNA。基因工程：实现基因克隆所采用的方法及

2、相关的工作，又称为重组DNA技术(recom-binantDNAtechnology)。（二）工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶I逆转录酶DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。II类酶识别序列特点为回文结构。······GGATCC············CCTAGG······限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：钝性

3、末端(bluntend)粘性末端(stickyend)5´-端突出粘性末端3´-端突出限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端（compatibleend），可用连接酶连接。（三）目的基因应用重组DNA技术所要分离、获得的基因。1.cDNA(complementaryDNA):是指经反转录合成的，与RNA互补的单链DNA。以单链cDNA为模板，经聚合反应可合成双链cDNA。2.基因组DNA（genomicDNA）：是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体及线粒体）的所有

4、DNA序列。（四）基因载体（vector）能携带目的基因，实现无性繁殖所采用的可独立复制的完整DNA分子。又称克隆载体。其中为表达出蛋白质设计的载体又称表达载体。常用的载体：质粒、噬菌体DNA、病毒DNA载体的选择标准：能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。1.质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。2

5、.噬菌体（phage）DNAλ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列3.其他柯斯质粒（cosmid）酵母人工染色体载体（yeastartificialchromosome,YAC）细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）二、重组DNA技术基本原理1、目的基因的获取2、基因载体的选择与

6、构建3、目的基因与载体的拼接4、重组DNA分子导入受体细胞5、筛选并无性繁殖含重组分子的受体分子（转化子）（一）目的基因的获取1.化学合成法用于已知序列，或可推导出序列的基因2.基因组DNA基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）3.cDNAcDNA文库（cDNAlibrary）4.聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）基因组DNA文库存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。简称G－文库。cDNA文库用细胞总mRNA制备全套双链cDNA后，建立的基

7、因文库。简称c－文库。PCR是根据DNA复制的原理，在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术。PCR的反应体系：模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP及含有Mg2＋的缓冲液。PCR的基本反应步骤：1.变性：将反应系统加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链；2.退火：将温度下降至50℃左右，使引物与模板DNA退火结合；3.延伸：将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤为一个循环，经25～30次循环后，可将模板DNA扩增达百万倍。（二）克隆载

8、体的选择（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接2.平端连接限制性内切酶作用产生的平端粘端经特殊酶处理变为平端3.同聚物加尾连接由末端转移酶作用，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端再连接。4.人工接头由平端加上带有新的酶切位点的寡核苷酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行连接。（四）重组DNA导入受体菌受体菌条件：安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态导入方式：