项目一动物组织中核酸的提取与鉴定

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1、动物组织中核酸的提取与鉴定项目一一、实验目的学习和掌握用盐溶法从动物组织提取核酸的原理和操作技术。了解定性鉴定核酸的原理和方法。二、实验原理根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离提纯的目的。三、实验材料试剂地衣酚（orcinol）试剂：称取100mg地衣酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O，该溶液应在使用前新鲜配制。二苯胺试剂：称取1g二苯胺（经重结晶）溶入100ml冰醋酸中，再加入2.75ml浓H2S

2、O4摇匀，冰箱内保存备用。三、实验材料试剂0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸），250ml；1mol/L氯化钠溶液，250ml；95%乙醇（冷）；氯仿；异戊醇。三、实验材料实验器材冷冻离心机（3000rpm）；组织捣碎机或组织匀浆器；不锈钢剪刀；冰浴；试管、试管夹；量筒、吸管；带塞比色管、带塞离心管。玻棒、烧杯；电炉等。四、实验方法1.制匀浆将新鲜肝脏或冷冻肝脏称重后用冷的0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）洗去血水，用不锈钢剪刀将肝脏剪成碎块，放入组织捣碎机中加入2倍体积的0.14mol/LNaCl溶液（内含

3、0.01mol/L柠檬酸）制备匀浆。将匀浆置离心机中离心20min（3000rpm）。上层液倾出留待抽提RNA，下层用二倍体积冷的1mol/LNaCl溶液抽提1h，待分离DNA核蛋白。四、实验方法2.核酸的抽提RNA的提取0.14mol/L的NaCl抽提液（内含RNA核蛋白）加入等体积的氯仿和1/40体积的异戊醇，置带塞离心管中，振摇30min，此时提取液为乳白色混悬液，以3000rpm离心15min，离心物呈三层。用滴管吸出上层清液，在低温下加入1.5~2倍的冷95%乙醇，并轻轻搅拌。低温放置15min，3000rpm离心10min，弃去上清液，即得RNA

4、颗粒状沉淀，待定性。四、实验方法2.核酸的抽提DNA的抽提将抽提1h的1mol/LNaCl匀浆悬液以3000rpm离心20min，弃去沉淀，将其上清液倒入带塞的离心管中，加入等体积的氯仿及1/40体积的异戊醇振摇30min，离心20min。将其上清液加入2倍体积的冷95%乙醇，边加边摇，抽出玻棒，纤维状DNA就缠绕在玻棒上待定性。每次都需采用冷冻离心。四、实验方法3.定性试验RNA的呈色反应取2支干净试管，一管加入1.5mlRNA溶液，另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入3ml地衣酚试剂，于沸水中加热10min，由黄色变为绿色为阳性反应。DNA的呈色反应

5、取2支干净试管，一管加入1.5mlDNA溶液，另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入3ml二苯胺试剂，于沸水中加热10min，由乳白色变为蓝色为阳性反应。五、注意事项在提取分离纯化核酸时，为了保持核酸的完整性，防止核酸变性降解，操作时必须防止过酸或过碱。全部过程应在低温下(0℃左右)进行，必要时还需加入抑制剂，以抑制核酸酶的作用。加氯仿、异戊醇后振摇要充分，但又不能太剧烈，以防DNA断裂。要学会正确使用离心机，离心后，注意上清液和沉淀的取舍。六、项目总结及练习1.从动物组织（猪肝）中提取核酸，第一步是破碎肝脏组织细胞，请问破碎动物细胞的物理方法主要有哪些？

6、（列举5种）①研磨法；②组织匀浆法；③渗透压变动法；④超声波处理法；⑤反复冻融法等。六、项目总结及练习2.为什么在0.14mol/LNaCl溶液中要加0.01mol/L的柠檬酸，或者说，柠檬酸或柠檬酸钠的作用是什么？与柠檬酸作用相同的物质还有哪些？（最少1种）在核酸提取过程中要防止核酸降解。DNA酶可降解DNA，但DNA酶的活性需要Mg2+、Ca2+等金属二价离子的激活，柠檬酸或柠檬酸钠能螯合这些金属二价离子，从而抑制DNA酶的活性。与柠檬酸作用相同的物质还有EDTA、TA等，它们都是金属螯合剂。六、项目总结及练习3.猪肝经组织捣碎机破碎细胞，制得的匀浆于3

7、000rpm离心20～30min，所得沉淀用二倍体积1mol/LNaCl溶液抽提1h。请问什么叫抽提？抽提是指在一定条件下，用适当的溶剂处理，使细胞破碎后的目的成分充分地溶解到提取液中的过程。六、项目总结及练习4.RNP和DNP经0.14mol/LNaCl溶液处理并离心分离后，可分别用蛋白质变性沉淀剂来去除其中的Protein。请列举4种常用的蛋白质变性沉淀剂。①氯仿；②苯酚；③十二烷基硫酸钠（SDS）；④三氯醋酸等。六、项目总结及练习5.为有效去除RNP和DNP中的Protein，本项目采用等体积的氯仿及1/40体积的异戊醇振摇30min。请问异戊醇的作用

8、是什么？异戊醇的作用是消泡和有助于分相。六、项目总结