实验一-动物肝脏组织中基因组DNA提取和鉴定.ppt

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1、实验一动物肝脏组织基因组DNA的提取（高盐法）1核酸的分类DNA(脱氧核糖核酸)主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA（核糖核酸）存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。2核酸的理化性质在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在。溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来。3浓盐法：利用RNA和DNA在不同

2、盐浓度溶液中的溶解度不同将二者分离。离子去污剂法：利用SDS、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）等去污剂使蛋白质变性，直接从生物材料中提取DNA。苯酚抽提法：苯酚既是蛋白变性剂，又能抑制DNase的降解。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA连接键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。基因组DNA的提取方法4核酸提取的主要步骤破碎细胞：研磨、组织匀浆、超声、冻融；异硫氰酸胍、碱裂解；酶解（溶菌酶）除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子：酚/氯仿抽提、蛋白变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）、蛋白酶处理、高盐洗涤除去其它不需要

3、的核酸分子沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质5注意事项避免过酸、过碱及高温加入DNA酶抑制剂：柠檬酸、氰化物、砷酸盐、EDTA、SDS、苯酚等蛋白变性剂反应不宜过于剧烈加入RNA降解酶除RNA6学习并掌握用高盐法从动物肝脏组织中的提取基因组DNA方法及其原理。一、实验目的7二、实验原理核酸在真核细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，用DNP和RNP表示。DNA-Pro（DNP）(存在于细胞核)RNA-Pro(RNP)(存在于核仁及细胞质)溶于高盐溶液（1mol/L）,微溶于低盐溶液（0.14mol/L）溶于低盐溶液（0.14mol/L）微溶于高盐溶液（1mol/L）8三、仪器

4、和试剂1、仪器：低速离心机、落地式高速冷冻离心机、摇床、稳压电源、电泳槽、凝胶成像系统。2、试剂：0.14mol/LNaCl－0.15mol/LEDTA(pH=8.0)；2.5mol/LNaCl；25%SDS；氯仿/异戊醇=24:1（V/V）；95%乙醇；1×TAE；琼脂糖；上样缓冲液。9四、实验步骤1、DNA的提取（1）称取5g鸡肝，置于预冷的研钵中，在冰浴中剪碎，加入10mL预冷的0.14mol/LNaCl-0.14mol/LEDTA溶液，研磨成匀浆液。（2）将匀浆液加入到15mL刻度离心管中，2000r/min离心10min，弃去上清液。（3）将沉淀转移至50mL离心

5、管中，加入10mL预冷的0.14mol/LNaCl-0.14mol/LEDTA溶液，充分摇匀后，于4℃2000r/min离心10min，弃去上清液。10四、实验步骤1、DNA的提取（4）将上述沉淀转移至100mL锥形瓶中，加入10mL预冷的0.14mol/LNaCl-0.14mol/LEDTA溶液，缓慢搅拌，同时加入750uL25%SDS溶液，用封口膜封口，置于摇床中，30℃150r/min震荡30min。（5）加入7mL2.5mol/LNaCl，用封口膜封口，置于摇床中，30℃150r/min震荡10min。。（6）再加入17mL氯仿:异戊醇溶液，用封口膜封口，置于摇床中

6、，30℃150r/min震荡20min。。11四、实验步骤1、DNA的提取（7）将混合液转移至50mL刻度离心管中，3500r/min离心10min，取上清至一个新的50mL刻度离心管。（8）加入20mL95%乙醇溶液，上下颠倒混匀后，出现丝状物，用枪头挑取丝状物，或者3500r/min离心5min。（9）弃去上清液（注意：缓慢倒去上清液），沉淀物质即为DNA，空气干燥后即可加入适量的TE缓冲液。12四、实验步骤2、DNA电泳检测（1）1%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖，加入30mL1×TAE缓冲液，在微波炉中加热，反复加热、振荡2-3次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至60

7、℃左右，倒入插入梳子的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。（2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。（3）上样电泳：将适量DNA样品溶液和上样缓冲液混匀后，上样，100V电泳检查，根据指示剂迁移的位置，13四、实验步骤2、DNA电泳检测（3）上样电泳：将适量DNA样品溶液和上样缓冲液混匀后，上样，60V稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。（4）照胶、拍照：将凝胶泡在EB溶液（注意：EB