动物组织核酸的分离、鉴定和含量测定

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1、动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定1.猪肝基因组DNA分离2.核酸的定量和纯度测定3.脱氧核糖的显色实验核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内，是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式--核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等现象起着重要的决定作用核酸分为两大类--核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷

2、酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定DNA和RNA的结构基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以

3、保证得到较长的DNA。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。1.猪肝基因组DNA的分离核酸分离的原则在溶解细胞的基础上，利用有机溶剂抽提蛋白质（核酸溶于缓冲液，即水相），分离，纯化；利用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀核酸，收获核酸分离的一般步骤1溶解细胞溶解细胞的方法因样品不同而不同，如十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate,SDS）加EDTA法、蛋白酶消化法、强碱法、超声破碎加冻融等。2有机溶剂抽提苯酚使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的目

4、的。3纯化为了得到纯的核酸，可用蛋白酶除去蛋白；用RNA酶除去RNA，得到纯的DNA；用DNA酶除去DNA，得到纯的RNA。4沉淀为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸，再通过离心回收核酸，然后用70%-80%乙醇洗涤沉淀，除去多余的盐，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。核酸分离试剂盒:可简单、快速地分离得到纯度很高的DNA或RNA，其分离原理是在特定溶液环境下（高盐、低pH)使核酸吸附在固相介质（一般是硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE中，以达到分离、回收核酸的目的。盐溶法分离DNA和RNA的原理根据RNA

5、与DNA在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离：在0.14M的氯化钠溶液中，RNA核蛋白溶解度大，而DNA核蛋白溶解度小；相反在1M的氯化钠溶液中，DNA核蛋白的溶解度大，而RNA核蛋白的溶解度小，从而使DNA和RNA核蛋白分开。然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离DNA和RNA的目的。酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提酚：有效的使蛋白质变性，不能完全抑制RNA酶的活性，能溶解带有长poly(A)的RNA分子。使用前必须用水饱和并用Tris平衡至pH>7.8，以防止DNA分配到有机相。氯仿：强烈的脂溶性，去除

6、脂类杂质，增加有机相比重。纯酚的比重为1.07，有机相和水相有时很难分开。加入氯仿（比重为1.47）可以避免这一问题。同时，酚有时会微溶于水，可以用氯仿将水相中的酚去除。异戊醇：降低表面张力，减少气泡产生，使离心后的水相、变性蛋白相及有机溶剂相维持稳定。实验步骤1.2g挤干乙醇后加1mlSC液溶解2.核酸的定量和纯度测定紫外分光光度法:定量：260nm下，1OD相当于50ug/ml双螺旋DNA，40ug/ml双链RNA检测纯度：纯的DNAA260/A280=1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时，A260/A280比值降低。定糖法:DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部

7、分为核糖，分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法定磷法:测定核酸的磷酸部分实验方法1mlSC溶液溶解DNA，8000rpm离心5分钟后，将上清转移到5ml离心管中，用1ml0.01MNaOH溶液加入沉淀中，使其充分溶解，并再次离心5分钟，上清与第一次溶解液合并备用A260测定：以SC溶液作为空白，取上清测A260值（OD<3.0即在测量范围之内），并计算DNA浓度（1OD=50mg/mlDNA）A280测定：A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于