工程菌精美生物医学

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1、第四节基因工程菌培养与发酵什么是基因工程菌？培养和发酵基因工程菌的目的是什么最常用的基因工程药物表达系统是什么？基因工程菌的发酵受到哪些条件的影响？一、概念工程菌是采用现代生物工程技术加工改造，被转入了外源目的基因的新型微生物具有多功能、高效和适应性强等特点。治理海洋石油泄漏生产基因工程药物培养和发酵的目的：外源基因能高水平表达，能获得大量外源基因产物【其实是指蛋白质的产生，表现出对应的作用】最常用的基因工程药物表达系统（工程菌体系）大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞二、工程菌生长繁殖需要的条件①良好的物理环

2、境:主要有发酵温度、PH值、溶氧量等。②合适的化学环境:适宜工程菌生长代谢所需的各种营养物质的浓度,并限制各种阻碍生长代谢的有害物质的浓度三、基因工程菌常用的发酵方法1、批式培养　   指营养物和工程菌株一次加入进行培养,直到培养结束放出,中间除了空气进入和尾气排出、酸碱调解PH值外与外部没有物料交换。传统的生物制品发酵多用此过程。2、流加式培养　   是一种发酵过程中优化化学环境的一种有效方法,在批式培养基础上,改善批式培养过程中由于营养物质的消耗造成的重组细胞营养不足,调整了工程菌所处的生长环境,

3、使工程菌一直处于最佳状态工程菌在保存、发酵过程中不稳定，成为制约基因工程转变为生产力的关键之一。四、工程菌的稳定性外在表现：得不到表达产物、或达不到要求产量。本质：质粒不稳定；表达产物不稳定。内在表现：质粒丢失；重组质粒DNA片段脱落。1、工程菌不稳定性的表现质粒丢失：由环境因素或生理、遗传学原因，质粒从宿主中丢失，丢失率因环境、宿主、质粒结构而有不同。重组质粒上一部分片段脱落：表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。表达产物不稳定：人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的延长，干扰素活性反而下

4、降。影响工程菌稳定性的因素：（1）质粒结构：质粒稳定区受到影响，重组质粒上有重复序列等。（2）宿主：宿主中重组基因的完整性、重组时有关基因的变异等。（3）环境因素：高温、去垢剂、某些药物(如利福平)、染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的丢失。（1）组建合适载体构建质粒时，插入一段特殊的DNA片段或基因，使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。（2）选择适当宿主在选择宿主时，须确定其遗传特点。重组质粒在大肠杆菌中较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。2、解决工程菌不稳定的对策（3）施加

5、选择压力a抗生素添加法通常在重组质粒上含抗药性基因。转入不耐药的宿主后，工程菌获得了抗药性。发酵时，培养基中加入抗生素，可阻止丢失质粒的非生产菌生长。b抗生素依赖变异法诱变使宿主成为某抗生素的依赖性突变株，而重组质粒上含有该抗生素的非依赖性基因。发酵生产时，不向培养基中加抗生素就能起到消除重组质粒不稳定的影响。c、营养缺陷型法诱变使宿主成为营养缺陷型，将相关基因插入到重组质粒中，选择基础培养基使失去重组质粒的细胞不能存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。（4）控制基因过量表达外源基因表达水平越高，重组质粒

6、越不稳定，如果外源基因的表达受到抑制，则重组质粒不可能丢失。可采取两阶段培养法。（5）控制培养条件众多环境因素中，培养基组成、培养温度、菌体的比生长速率尤为重要。对一个已经组建完成的克隆菌来说，选择最合适的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。（6）固定化重组菌以提高基因工程菌的稳定性。五、基因工程菌生长代谢的特点菌体的生长通常用比生长速率来表示。工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。控制菌

7、体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。（一）菌体的生长与能量的关系碳源物质是组成培养基的主要成分当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。（二）菌体生长与前体供应的关系在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌

8、体比生长率提高，蛋白合成增加。六、基因工程菌发酵（一）基因工程菌的培养过程⑴通过摇瓶操作基因工程菌生长的基础条件如温度、pH、培养基各种组分、碳氧比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响;⑵通过培养罐操作确定培养参数和控制方案以及顺序。菌种一级种子摇瓶二级种子罐培养扩大培养原料发酵培养灭菌发酵生产代谢产物分离基配制微生物工业发酵过程简图（二）基因工程菌的发酵工艺基因工程菌的发酵不仅涉及宿主、载体和克隆基因之间的相互关系还和