分子杂交精美生物医学.ppt

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1、分子杂交技术与应用分子杂交技术的目的是什么？分子杂交的基本方法有哪些？Southern印迹法有哪些步骤，为了达到什么目的呢为什么叫印迹法呢？一、核酸分子杂交的基本原理与分类（一）核酸分子杂交的基本原理1、变性（denaturation）（1）定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。（2）.引起核酸变性的因素酸碱热变性剂（尿素）有机溶剂（乙醇）（3）、变性后核酸的特点：粘度下降密度增加紫外吸收增加2、融解温度（Tm）：定义：在DNA热变性时，其A260的升高达

2、最大值一半时的温度。3、复性（退火）变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。影响复性速度的因素：DNA浓度DNA片段的大小DNA片段复杂性合适的复性温度适当的离子强度4、杂交定义两条来源不同，但具有互补序列的核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，这个过程即分子杂交。DNA/DNA的杂交作用：检测特定生物有机体之间的亲源关系DND/DNA或RNA/DNA：揭示核酸片断中某种特定基因的位置。1975，Southern印迹杂交法:DNA1977，Northern印迹杂交法：RNA1979，Western

3、印迹杂交法：Protein由Southern1975年设计。被检测对象为DNA。二、Southern印迹杂交具体研究什么呢？克隆基因DNA的酶切图谱分析【哪里可以剪开】基因组中某一基因的定性与定量分析【有没有这个基因；在哪里】基因点突变【在哪个地方出现突变】限制性片段长度【可以被剪开的片段多长】带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印迹杂交的技术流程（一）待测核酸样品的制备提取待测DNA用限制酶

4、将DNA切成大小不同的片段用EDTA，65℃灭活限制酶，进入下一步骤——电泳分离片段。（二）电泳分离DNA片段目的：确定杂交靶分子的大小【待测片段】原则：分辨大片段用低浓度胶；分辨小片段用高浓度胶如何确定片段大小：用marker【标准分子量DNA】胶的注意事项有四条，一起来看书：（三）印迹转移前凝胶的预处理分子量不同所需转移的时间不同；浸泡在0.25M的HCL溶液中脱嘌呤再进行碱变性，待测DNA链断裂单链，以便与已知序列的DNA杂交（四）转膜（印迹）谁转移？将凝胶中已成单链的待测DNA片段转移到哪里？膜：固相支持物，常用N

5、C膜和Nylon膜转移后有什么特点？转到膜上的相对位置跟在凝胶中的一样（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片白瓷盘玻璃板滤纸凝胶尼龙膜滤纸吸水纸玻璃板重物吸水纸转膜硝酸纤维素（NC）膜不能滞留小于150bp的DNA片断，不能同RNA结合。RNA变性后也能十分容易的结合到膜上尼龙膜：耐用，结合力强，但其本底高。本底：指没有进样时检测到的信号值.尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤：1.核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用2.印迹杂交：将

6、具有核酸印迹的滤膜和带标记的DNA/RNA进行杂交。（五）、核酸探针1、探针（probe）的概念指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。例如抗原-抗体等均可看成是探针与靶分子的相互作用。基因探针指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链。2.探针种类（1）基因组DNA探针为某一基因的全部或部分序列。（2）cDNA探针以mRNA为模板经逆转录产生的DNA链。（3）RNA探针以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。（4）寡核苷酸探

7、针3.探针的选择高度特异性，一般探针越长，杂交作用越强，其专一性也越强。4、探针基本条件（特点）标记物（32p,35S,125I,地高辛（DIG）,FITC）单链核酸（ssDNA）高特异性（~500bp）标记物稳定灵敏，检测方便安全（1）、标记物放射性同位素标记物非放射同位素标记物探针标记物放射性标记物：32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、125I(60d)非放射性标记物：半抗原：生物素、地高辛荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）a、放射性标记物特点：●可用放射自显影技术检测，信号的强弱易于进行定量分析

8、。主要缺点射线对人体有伤害放射性物质需特殊的处理半衰期短不宜存放使用B、非放射性标记物常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、荧光素。特点：敏感性不如同位素标记稳定性和分辨率高检测时间短操作简便不需特殊的防护设备不存在放射性污染（六）核酸的固定1、烘烤80