《分子杂交》PPT课件

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1、核酸分子杂交NucleicAcidHybridization1分子杂交概念及应用分子杂交：在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其相对分子质量的大小。分子杂交实质上是DNA或RNA单链之间退火形成DNA/RNA或DNA/DNA杂合分子。应用范围：重组子鉴别基因分离DNA片段分析基因表达研究。。。。。。当用一个标记核酸分子与核酸样品杂交，便可以查明该样品中是否存在与该标记核酸分子具有同源性的分子。2探针的概念及其标记技术2.1探针(probe):用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RN

2、A或寡核苷酸。2.2探针的标记技术2.2.1均匀标记2.2.2末端标记2.2.1均匀标记⑴切口平移法标记DNaseIHOP5’3’5’3’5’3’DNaseI与PolI的切口移位PolI⑵随机引物标记⑶PCR扩增标记要求：[a-32P]dNTP5’3’5’3’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’热变性随机引物退火-32PdNTPKlenow酶~~5’5’~~5’~~----------------~~5’~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~2.2.2末端标记⑴DNA片段的末端标记Klenow酶3’-末端补平(3’-末端标记)

3、5’-ACGTTGCAAACTG-3’3’-TGCAACGTTTGAC-5’四种不同的补平反应5’-GGATCC-3’BamHI5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’3’-CCTAGG-5’dNTPdGTPdGTP/dATPdGTP/dATP/dTTP5’-GGATC5’-GG5’-GGA5’-GGAT3’-CCTAG3’-CCTAG3’-CCTAG3’-CCTAGGATCC-3’GATCC-3’GATCC-3’GATCC-3’CTAGG-5’GG-5’AGG-5’TAGG-5’IS1S1S15’-GGCC-3’5’-GGATCC-3’5’

4、-GGATATCC-3’3’-CCGG-5’3’-CCTAGG-5’3’-CCTATAGG-5’IIIIIⅣT4DNApolymeraseT7DNApolymeraseT4多核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)⑵合成寡核苷酸的标记T4多核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)3分子杂交技术根据检测对象的不同：Southern杂交Northern杂交Western杂交斑点杂交狭线杂交菌落杂交1975年,Southern印迹杂交（Southernblot）

5、由英国人埃德温·迈勒·萨瑟恩（EdwinMellorSouthern）创建。3.1Southern杂交埃德温·迈勒·萨瑟恩Southern杂交操作步骤：⑴印迹转移(blotting)将DNA片段从琼脂糖凝胶转移到滤膜的方式。印迹转移方式(1)——毛细管渗吸法白瓷盘玻璃板滤纸凝胶尼龙膜滤纸吸水纸玻璃板重物毛细管渗吸法真空转膜槽滤纸尼龙膜凝胶盖子印迹转移方式(2)—真空转膜印迹转移方式(3)——电转移⑵分子杂交①预杂交目的：将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，其中主要含

6、有鱼精DNA、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。②杂交在一定的溶液和温度下，将标记的探针与滤膜混合；⑶洗涤25℃1×SSC/0.1%SDS杂交温度0.25×SSC/0.1%SDS⑷放射性自显影或生化检测。带有DNA片段的凝胶DNA分子酶切片段限制性酶切琼脂糖电泳通过毛细管渗吸或电转移或真空转移方式80℃或紫外线处理将DNA固定在滤膜上杂交、显影凝胶滤膜0.4MNaOH溶液中DNA变性在1.5MNacl+1MTris中和，保存单链状态。吸附有ssDNA的膜Southern印迹杂交的技术流程Southern杂交EdwardSouthe

7、rn（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析Southern杂交的主要应用：判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。3.2Northern杂交印迹转移的是总RNA或mRNA。应用：在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。3.3Western杂交印迹转移的是蛋白质。将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应鉴别滤膜上的蛋白质。探针:针

8、对某一蛋白质制备的特异性抗体。以上分子杂交可以获得精确的结果，但操作繁杂。当样品量比较大时，难以满足试验需求