《核酸的分子杂交》PPT课件

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1、第四节核酸的分子杂交NucleicAcidHybridization核酸分子杂交：概念：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。DNA变性方法:热变性：90~100℃酸碱变性：常采用碱变性化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等DNA复性或杂交(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等ContentofTable一、核酸分子杂交技术的原理二、核酸探针的制备三、核酸探针的标记四、核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交技术的原理有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形

2、成双链结构。如把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列用合适的标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（probe),与变性后的单链基因组DNA或RNA等进行杂交。用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列的拷贝数及表达丰度等。应用：1）检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；2）用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。Home二、核酸探针的制备探针（Probe):一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。探针的制备方法探针长度一般以50~300bp为宜

3、。制备方法：1）利用DNA重组技术2）PCR扩增3）化学合成探针的分类：据制备方法及核酸性质不同，可分为：基因组DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针合成寡核苷酸探针注意原则：1）长度（10-50bp);2)G:C对含量40%-60%；3）探针内避免互补；4）避免同一碱基连续出现；5）与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。Home三、核酸探针的标记为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。1、标记的种类同位素：32P、35S、3H、125I等标记探针非同位素：生物素、地

4、高辛配体、荧光素等作为标记物两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。一个理想的标记物：1）标记前后探针的基本结构、化学性质相同;2）特异性强、本底低、重复性好；3）操作简单、节时；4）安全、无环境污染。2、探针的标记方法（1）缺口平移法（2）随机引物标记法（3）末端标记法（4）生物素光照标记法缺口平移法的原理将DNAaseI的水解活性与大肠杆菌DNApolymeraseI的5`→3`的聚合酶活性和5`→3`的外切酶活性相结合。首先用DNAaseI在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNApolI的5`→3`外切酶

5、活性，切去带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。随机引物标记法原理用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`-OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。末端标记法原理（1）一种是在5`末端加成标记法：先用碱性磷酸酶

6、（AP）去掉dsDNA5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP转移加到DNA片段5`-OH上。（2）在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的ddUTP。生物素光照标记法光敏生物素在紫外线照射下与DNA或RNA的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的DNA探针。Home四、核酸分子杂交技术此技术由Southern1975年首先设计。被检测对象为DNA。（一）Southern印迹杂交带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southe

7、rn印迹杂交的技术流程（二）Northern印迹杂交与Southern杂交类似。检测目的RNA的存在与否及含量。（三）Western印迹杂交将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。（四）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交Dotblottingandslotblotting直接将样品点样于固相支持物上。适合于核酸样品的定性检测，而不是定量检测。(五）原位杂交insituhybridization将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点

8、能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能