核酸及核酸分子杂交1ppt课件

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1、第一章核酸的分子结构、性质和功能主要内容第一节核酸是遗传物质第二节核酸的结构第三节核酸的功能第四节核酸的变性、复性和杂交第五节病毒核酸第六节反义核酸第一节核酸是遗传物质核糖核酸（RNA）脱氧核糖核酸（DNA）核酸Griffith1928年发现了DNA为遗传物质Avery1944年证明了DNA为遗传物质Watson和Crick1953提出了DNA双螺旋第二节核酸的结构一、DNA的结构一级结构、二级结构、三级结构、拓扑结构二、RNA的结构一级结构DNA分子的脱氧核糖核苷酸残基的排列顺序三级结构DNA中单链与双链、双链之间形成的三链或四链结构拓扑结

2、构和四级结构拓扑结构：正超螺旋、负超螺旋四级结构：DNA与一些蛋白质因子相互作用形成的结构第三节核酸的功能一、DNA的功能二、RNA的功能(一)hnRNA和mRNA的功能(二)rRNA的功能（三）tRNA的功能(四)snRNA、scRNA（五）核酶第四节核酸的变性、复性和杂交一、核酸的变性二、核酸的复性三、核酸的杂交与应用四、生物芯片——基因芯片三、核酸的杂交与应用杂交含义：序列互补单链的RNA和DNA，或DNA与DNA，或RNA和RNA，根据碱基配对原则，借助氢键相连而形成双链杂交分子的过程杂交Southern印迹Northern印迹Wes

3、tern印迹原位杂交杂交（一）探针及其标记物（二）影响杂交的因素探针及其标记物1、（核酸）探针（probe）：指带有标记物，能与被检测的核苷酸片断互补的一段已知核苷酸片断。理想探针必须具备以下几点：探针必须是一段已知的核苷酸序列必须加以标记，便于杂交后检测探针及其标记物探针标记物可分为放射性和非放射性两大类放射性核素标记：32P、3H、35S等非放射性标记物：（1）生物素：与UTP和dUTP嘧啶环的5位碳相连（2）光敏生物素（3）地高辛：类固醇半抗原化合物，与嘧啶环相连（4）荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）呈黄绿色荧光，试卤灵呈现红色荧光、

4、羟基香豆素呈现蓝色荧光影响杂交的因素探针的浓度和长度：浓度0.5-5.0ug/ml，探针长度50-300bp杂交的温度和时间：比Tm低20-25°C，杂交时间16h杂交液中的甲酰胺：降低杂交溶液温度离子强度：〈0.1mol/LNa+，盐浓度越高，杂交率越高非特异性杂交反应：对非特异性位点进行封闭，常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA；一些高分子化合物，如Denhardt氏溶液，脱脂奶粉Southern印迹具体步骤1、待测核酸制备2、限制性内切酶的消化3、琼脂糖凝胶电泳4、原位DNA变性5、DNA转移至硝酸纤维素滤膜6、预杂交7、杂交8、洗脱9、

5、放射自显影3、琼脂糖凝胶电泳分离大分子DNA片段（800~12000bp）用低浓度琼脂糖（0.7%）凝胶分离小分子DNA片段（500~1000bp）用高浓度琼脂糖（1%）凝胶分离300~500bpDNA片段用1.3%浓度琼脂糖凝胶4、原位DNA变性将电泳后的DNA凝胶置于碱溶液中浸泡15min，使双链DNA变为单链DNA然后，换到中和缓冲液中浸泡30min。5、转移将DNA转移至硝酸纤维素膜上裁一张硝酸纤维素膜、2~4张滤纸和一些吸印纸，都与胶大小相同A．将长的滤纸放在转移平台的顶部，滤纸两端达到转移盒的底部，做成虹吸桥。B．将80mL转移

6、液倒入转移盒内，并湿润滤纸。C．将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上，凝胶与滤纸间避免有气泡。D．用保鲜纸封住凝胶四边。E．将浸湿的转移膜置于凝胶的上部，凝胶与膜间避免有气泡。F．将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面，并放一叠吸水纸搭在滤纸上，再放一玻璃板，其上压一重物G．转移几小时或过夜(至少4小时)转膜6、预杂交将膜上所有能与DNA和一些大分子物质结合的位点全部封闭。一般用变性的非特异性DNA，如鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。另一类是用一些高分子化合物，一般用Denhardt氏溶液（含聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白），也可

7、以用脱脂奶粉7、杂交将放射性核素标记的变性后DNA探针进行杂交，杂交一般在较高的盐浓度及适当的温度下进行数小时或几十小时核酸杂交流程图Northern杂交与southern不同之处1、RNA在凝胶电泳时须经变性处理2、电泳结束后，RNA不经任何处理，可直接转移到膜上3、RNA-DNA杂交不如DNA-DNA杂交强烈4、在RNA电泳中，18S和28S的大小可以作为一项指标检测RNA的质量状况四、基因芯片概念：基于碱基互补原理，在固体硅片或玻璃芯片表面用大量的基因探针按一定的序列集成的芯片基因芯片的主要类型：基因芯片的杂交及检测基因芯片的应用基因芯

8、片的主要类型根据支持物不同：无机片基和有机片基根据探针阵列的形式：原位合成和预先合成然后点样根据芯片的功能：基因表达芯片和DNA测序芯片基因芯片的杂交及检测杂交杂交