分子杂交技术.ppt

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1、第一节分子杂交的原理核酸分子杂交（nucleicacidhybridization）指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键（主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成的新的双链分子——杂交分子若所用的核酸探针的片段较长(几百个核苷酸以上)，可以得到很准确的鉴定结果

2、。但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短（如20～30个核苷酸），则难免会出现准确性差的假阳性现象。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。杂交的双方：探针和要检测的核酸。将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。被检测的核酸：克隆化的基因组DNA提纯的细胞总DNA细胞内杂交（细胞原位杂交）细胞总RNA变性复性DNA-DNA杂交双链分子杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。一、DNA变性与复性（一）

3、DNA变性1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性2、变性的方法：（1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。GC含量与Tm值之间的关系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.3（二）复性1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或

4、杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。2、复性过程（1）单链分子间碰撞形成局部双链（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列（4）形成完整的双链分子二.分子杂交的一般程序待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未参与杂交的探针检测杂交信号制备探针核酸片段探针标记加入标记核酸探针电泳制备DNA或RNA样品→与固定基质结合→80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交→洗涤→放射自显影或

5、显色反应。三、核酸探针的制备探针（Probe)的概念:一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。1.探针的制备方法长度一般以50~300bp为宜，有时达1.5kb。制备方法：(1)DNA重组技术(2)PCR扩增(3)化学合成2.探针的分类据来源及性质不同可分为：(1)基因组DNA探针(2)cDNA探针(3)RNA探针(4)寡核苷酸探针合成寡核苷酸探针注意原则(1)长度（10-50bp);(2)G:C对含量40%-60%；(3)探针内避免互补；(4)避免同一碱基连续出现；(5)与非靶序列有70%以

6、上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。3.核酸探针的标记为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。标记的种类同位素：32P、35S、3H、125I等标记探针非同位素：生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物第二节核酸分子杂交的方法按其分子种类划分（1）Southern印迹杂交（2）Northern印迹杂交3）Western印迹杂交按待测核酸是否固定在固相支持物上分：固-液相杂交膜上印迹杂交原位杂交液相杂交RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法一、Southern杂

7、交其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。DNA经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。步骤：酶切DNA,凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。(

8、2)将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。(3)预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。(4)让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。(5)通过显影检查目的DNA所在的位置。带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液