《分子杂交技术》PPT课件(I)

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1、分子杂交技术分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物分子的一门技术。样品制备电泳杂交转膜结果显示探针制备分子杂交原理及流程图一.分子杂交种类1.按其分子种类划分1）DNA杂交—探针为DNA或RNA2）RNA杂交—探针为DNA或cDNA3）蛋白质免疫分析—探针为抗体2.按样品制备过程划分1）原位杂交(insituhybridization)i.原位菌落杂交ii.原位噬菌斑杂交iii.原位细胞杂交iv.原位组织块杂交原位裂解细胞，不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品，可同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存

2、在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。2）斑点杂交(dothybridization)先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上进行杂交，不能测定分子量大小。一.分子杂交种类3）转移杂交或印迹杂交(blottinghybridization)先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体基质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。用于转移的方法有：i.扩散法ii.毛细管法iii.电泳转移法iv.真空转移法4)夹心杂交法(sandwichhybridization)它利用两种探针与待测DNA结合，先将不

3、带标记的探针固定在基质上，然后用待测样品与之杂交，洗去非特异性结合后，再与第二种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制DNA样品，可检测出0.2ng的DNA样品一.分子杂交种类1)DNA和RNA的杂交制备DNA或RNA样品→与固定基质结合→80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交→洗涤→放射自显影或显色反应。2）蛋白质的免疫分析制备蛋白质样品→与固定基质结合→常温空气中固定→封闭剂封闭→一抗反应→洗涤→二抗-酶偶联物反应→洗涤→显色反应（EIA）或→一抗放射标记物→洗涤→放射自显影（RIA）二、分子杂交的一般程序1.固定基质的种类与特性1）

4、硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulosefilter,NCF)可与三类大分子的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。NCF不能结合小分子DNA，RNA和蛋白质（<20,000）优点：i.用于DNA，RNA杂交分析时结果可靠，灵敏，本底低。ii.用于蛋白质分析时，容量大（80μg/cm2)；可直接染色；分辨率高；不需要预激活；易于操作缺点：结合低分子蛋白质不稳定，反复使用探针次数有限（2-3次）2）重氮化纸：DBM纸与DPT纤维素纸最大特点是能结合小分子的DNA，RNA和蛋白质，共价结合，可用不同探针进行多次杂交分析。该类基质结合生物大分

5、子的能力差，需要激活，分析蛋白质时最好用放射性标记物。这类基质对生物大分子是主动吸附。三、杂交样品膜的制备3)尼龙膜i.阳离子尼龙膜i)容量大,蛋白质可结合480μg/cm2ii)可结合不同大小的DNA，RNA和蛋白质。iii)韧性好iv)可用于电转移v)可进行反复多次杂交试验vi)广泛的化学耐受性和可高温消毒*不能用于蛋白质的直接染色。ii.尼龙66广泛用于核酸印迹分析，静电荷可从pH4时阳离子状态转变为pH7时阴离子状态，电转移时要注意。4）离子膜i.DEAE-纤维素纸ii.CM-纤维素纸三、杂交样品膜的制备2.固定基质的选择依据1）

6、强度，耐久性，操作简便2）高信噪比（低本底高信号）3）生物大分子的结合容量和稳定性4）重现性好三、杂交样品膜的制备3.各种杂交样品膜的制备1）原位杂交样品膜的制备i.原位菌落杂交样品膜三、杂交样品膜的制备(1)在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。(2)用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322)的菌落。(3)倒置平板,于37℃培养至划线的细菌

7、菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。(4)用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂,在3个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。(5)用Parafilm膜封好主平板,倒置贮放于4℃,直至获得杂交反应的结果。(6)裂解细菌,按本段下面所述方法,使释放的DNA结合于硝酸纤维素滤膜。i)细胞培养（高密度，几百—十万个菌落或低密度，几百个以下）ii)细菌细胞原位裂解与DNA变性ii.原位噬菌斑杂交样品膜i)细胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板）ii)噬菌体转移—用NCF作影印iii)DNA变性与固

8、定（与上同）2）斑点杂交样品膜的制备制备样品→点样→固定（可用斑点杂交仪或直接点样）3）转移杂交样品膜的制备i.扩散法（Difusionblottingmethod)ii.毛细管法(Capil