核酸提取精美生物医学

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1、核酸提取操作与含量测定找答案……核酸分离提取的原则是什么？要达到哪些要求？DNA和RNA提取总需要注意的要点有哪些？核酸如何定量测定，简单说说它们的依据呢？核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。前言一、核酸的分离原则及要求（一）分离核酸的一般原则因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。1、核酸的分离和纯化时应遵循两个原则：2、核酸的纯度要求①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶

2、剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。（三）核酸分离纯化的注意事项为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；②减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4～10条件下进行；③防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯

3、合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素；④减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及DNA样品的反复冻融等。主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA等。高温，如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为0～4℃以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的

4、生物降解。破碎细胞→提取核蛋白→去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子→去除盐类、有机溶剂等杂质→纯化干燥二、核酸分离纯化的一般步骤DNA提取的几种方法基因组DNA的提取CTAB法SDS法其它DNA提取的几种方法非基因组DNA的提取质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法基因组DNA－CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙

5、醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，

6、避免褐变，使酚容易去除CTAB提取缓冲液的经典配方CTAB提取缓冲液的改进配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。基因组DNA－CTAB法CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－CTAB法SDS法原理基因组DNA－SDS法

7、SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度10mM20mM0.4M2%SDS法DNA提取缓冲液SDS法流程图（以动物组织为例）动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－SDS法基因组DNA－其它方法物理方式：玻璃珠法、超声波法、研