重组子导入和筛选精美生物医学

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1、重组子导入、表达与筛选找找看……重组DNA导入的目的是什么？请简单描述需要被纯化掉的对象转化率是什么？该怎么计算表达？影响转化率的因素是什么？一、重组DNA分子导入宿主细胞什么是转化（transformation）？将重组DNA分子引入细菌（原核细胞），使其在细菌体内扩增及表达的过程。什么是转染（transfection）?将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的DNA重组体导入真核细胞的过程。基因重组转染体外包装噬菌体噬菌体体外包装1原核细胞的转化（细菌转化）1)受体细胞的选择限制缺陷型:避免修饰和降解重组缺陷型：避免重组整合转化亲和型：较高的可转化性

2、遗传互补型：利于筛选感染缺陷型：防止感染宿主细胞原核细胞：大肠杆菌真核细胞：哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞重组体分子导入原核细胞感受态细菌：细菌表面正电荷增加，细胞壁和膜的通透性增加，利于DNA分子的吸附和吸收（1）CaCl2转化：细菌处于0度，二价阳离子存在的低渗溶液中，细菌膨胀成球形，处于感受态。此时加热在42度的热冲击下进入细胞，在培养基上生长数小时后球形细胞恢复原状并繁殖。转化效率为105~106/ug（2）电击法（electroporation）：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA进入微孔后，脉冲结束，细胞恢复。

3、实验简单，不需要制备感受态菌，转化效率高109~1010/ug[原理]利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。3）转化率：DNA分子转化宿主细胞获得转化子的效率什么叫转化子？导入外源DNA分子后能稳定存在的宿主细胞什么叫重组子？导入的外源DNA为重组DNA的转化子表达方式：A、转化子数/用于转化的DNA分子总数B、转化子数/宿主细胞总数计算示例，见书132页影响因素：重组DNA：分子量小，转化率高；亲和性强的质粒载体转化率高；ccc质粒D

4、NA载体转化率高受体细胞转化方法：电击法转化率最高；氯化钙法次之（1）农杆菌转化法2、导入植物细胞基因枪法基因枪法（genegun）是依赖高速的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术。（二）基因枪介法优点：（1）无宿主限制。可以对任何基因型材料进行转化研究；(2)靶受体几乎包括所有具有潜在分化能力的组织或细胞。（3）易于操作。缺点：如转化频率低、结果的重复性差，易导致基因沉默，实验成本较高等。（二）基因枪法3、导入动物细胞显微注射技术含目的基因的表达载体动物受精卵含目的基因的受精卵早期胚胎雌性动物输卵管或子宫转基因动物显微注射分裂分化移植发育脂

5、质体法重组体脂质体受体细胞含有目的基因的重组宿主细胞（如细菌）可以通过规模化的基因工程生产目的蛋白（如激素）找找看……基因表达系统有哪些？基因表达系统应该具有什么条件？重组子筛选的意义是什么？有哪些方法可以用来筛选重组子？最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。第一节基因的表达系统与表达策略宿主细胞的选择一、适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用易得廉价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、

6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。二、宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。②有各类菌株和载体系列。③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。④易培养，成本低。缺点：①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞

7、内产物，提取困难。②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。③蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。④其内毒素很难除去。酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。重组子的筛选和鉴定（一）根据载体的性状变化进行筛选1根据载体的抗药性标记进行筛选载体上的抗药基因：抗氨苄青霉素基因抗四环素基因抗卡那霉素基因等凡是转入了载体的细胞都获得了这种抗药性，可以在平板上生长菌落。当带有完整

8、抗药性基因的载体转化无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获得了抗药性，能在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落，而未被转化的宿