Tan第五章目的基因的导入和重组子的筛选.ppt

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1、本课程内容第二章基因克隆的工具酶第三章基因工程的载体第四章目的基因的制备第五章目的基因导入和重组子的筛选第六章外源基因的表达第七章基因操作的基本技术第八章植物基因工程及应用第九章动物基因工程及应用第十章医学基因工程及应用7/24/20211欢迎同学们听课！第五章目的基因导入和重组子的筛选5.1DNA片段的连接重组5.2受体细胞选择的基本原则5.3基因转移5.4重组子的筛选7/24/20212欢迎同学们听课！5.1DNA片段的连接重组5.1.1DNA连接类型5.1.2DNA片段之间连接的方式5.1.3DNA重组中需注意的问题7/24/20213欢迎同学们听课！DNA分子连接不同的

2、DNA片段（目的基因和载体）经适当酶切后，在连接酶的作用下，连接在一起构建成重组DNA分子。7/24/20214欢迎同学们听课！5.1.1DNA重组（连接）的类型插入重组:载体上只有唯一的酶识别位点随机（非定向）插入置换重组(1)载体上有两个同样的酶识别位点随机（非定向）置换(2)载体上有两个不同的酶识别位点定向置换7/24/20215欢迎同学们听课！5.1.2DNA片段之间连接的方式具互补黏性末端片段之间的连接具平末端DNA片段之间的连接DNA片段末端修饰后进行的连接DNA片段加linkeroradaptor后的连接7/24/20216欢迎同学们听课！5.1.3DNA重组中需

3、注意的问题两端具相同粘性末端的DNA分子会发生自身环化。对于置换重组，需将切割的DNA分子经过凝胶电泳分离，回收目的片段。无论单酶切还是双酶切，目的DNA分子均可能发生串联，必需检测重组DNA插入片段的分子大小。7/24/20217欢迎同学们听课！5.2受体细胞及其选择的基本原则5.2.1受体细胞5.2.2受体细胞选择的基本原则7/24/20218欢迎同学们听课！5.2.1受体细胞受体细胞（receptorcell）：又称为宿主细胞或寄主细胞（hostcell）从实验技术上讲：是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。从实验目的上讲：是有应用价值和理论研究价值的细胞。7/24/2

4、0219欢迎同学们听课！5.2.2受体细胞选择的原则外源DNA分子能稳定存在，限制酶缺陷型；重组基因缺陷型；易于转化/转导；易筛选遗传稳定性高，易于扩大培养；安全性高；内源蛋白酶基因缺失或缺陷；遗传密码无明显偏好性；具有较好的转译加工机制；较高的理论和实践应用价值。7/24/202110欢迎同学们听课！5.3基因转移（genetransfer）载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分子：　　　a.未连接的载体分子　　　b.未连接的DNA片段　　　c.载体的自连　　　d.含有错误插入片段的重组DNA分子　　　e.重组DNA分子　　转化过程中，这些分子同时被转移到宿主

5、细胞内。未连接的分子即使被细菌摄取，只有在特殊的条件下才能复制，寄主的酶可降解这些DNA片段。自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入7/24/202111欢迎同学们听课！宿主细胞进行正常的复制。因此，需要将重组克隆鉴定出来。把重组DNA导入受体细胞进行扩增根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞及选择适宜的重组DNA导入的方式：转化、转染和转导。7/24/202112欢迎同学们听课！5.3基因转移（genetransfer）5.3.1重组质粒DNA分子转化大肠杆菌5.3.2重组噬菌体DNA分子转导大肠杆菌5.3.3重组DNA分子转入真核细胞7/24/202113欢迎同学们听课！5

6、.3.1重组质粒DNA分子转化大肠杆菌5.3.1.1细菌转化的机制5.3.1.2化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法）5.3.1.3电激法（电穿孔转化法）5.3.1.4转化率的计算及其影响因素7/24/202114欢迎同学们听课！5.3.1.1细菌转化的机制转化(transformation)：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化。自然界中，转化并不是细菌或的遗传信息的主要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的转化，进一步的研究发现，这类细菌含有DNA结合和吸收的代谢机制。正常条件下，大部分细菌包括大肠杆菌，只能吸收

7、有限的DNA，为了提高转化效率，建立了一系列的转化方法：a.热激法转化感受态细胞b.PEG介导的原生质体转化7/24/202115欢迎同学们听课！c.高压电穿孔法转化d.显微注射法转化e.接合转化f.噬菌体转染7/24/202116欢迎同学们听课！表4—1大肠杆菌常用转化方法的比较转化方法转化效率Ca诱导107-8原生质体转化105-6噬菌体转化107-8电穿孔法106-9（<100Kb）结合转化104-57/24/202117欢迎同学们听课！5.3.1.2化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌