目的基因的重组导入课件.ppt

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1、第五章目的基因导入受体细胞外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组DNA分子，该重组DNA分子必须导入适宜的受体细胞中方能使外源目的基因得以大量扩增或表达。外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞基因的重组与转移DNA体外连接应注意的事项：插入片段与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。决不能进行非互补粘性末端连接。第一节、DNA片段的体外连接EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3A、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性

2、末端。2.DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI当外源DNA以非定向的方式插入克隆载体时，需用测序或酶切的方法确定插入方向，上述两种方法或昂贵或费力。一种快速、简便的PCR法，即利用载体的通用引物和目的片段的两个特异性引物直接扩增重组菌落，从而达到鉴别DNA插入方向的目的。3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定位插入载体（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片段EcoRIEcoRIATGGA

3、ATTCT重组但移码突变！4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片段的用量（2）用碱性磷酸酶处理载体5’3’载体插入片段载体和外源DNA插入片段的连接结果受体细胞：原核生物细胞真核生物细胞酵母菌细胞植物细胞动物细胞第二节、重组DNA导入大肠杆菌大肠杆菌受体细胞的选择1、重组缺陷型：避免与受体基因组进行同源重组，便于重组DNA独立存在2、限制缺陷型:避免修饰和降解，使重组DNA稳定存在易于转化或转导：提高细胞的通透性，较高的转化率4、遗传互补型：有明显的选择性差异，有利于重组体筛选具有较好的翻译后加工，有利于真核基因表达6、感染缺陷型：防止感染，安全性高，无致病基因使用丧失了

4、限制修饰体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。1.菌种，大肠杆菌，枯草杆菌，蓝细菌2.外源DNA导入细菌的几种方法（1）转化（transformation)通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。（2）转染（transfection)噬菌体、病毒或以它们为载体构建的DNA重组体直接导入受体细胞而获得新的遗传表型。当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。（3）转导（transduction)用CaCl2处理大肠杆菌，细菌表面正电荷增加，细胞壁和膜的通

5、透性增加，利于DNA分子的吸附和吸收能增加膜的通透性。3、感受态大肠杆菌的制备当细菌处于0℃、二价阳离子（如Ca2+、Mg2+等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态；此时转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNA在42℃短时间热冲击后吸附在细胞表面而利于进入，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。制备原理制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用

6、冰冷的60mMCaCl2重悬3.重组质粒导入受体的转化方法大肠杆菌在0℃CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，球状细胞复原并分裂增殖。在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。（1）热激法或热休克转化法(Heatshocktransformation)10ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置10分钟42ºC1.5分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板

7、吸附DNA摄入DNA（2）电转化法转化效率高（高于109/gDNA）。在高压脉冲下，外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于DNA等大分子进入。脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L电转仪调为2.5kV,25F脉冲控制器200-4000.5g质