基因工程4-目的基因的分离和获得及重组基因的导入(中国药科大学生物工程所有课件).ppt

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1、第四节基因的分离和获得中国药科大学生物制药教研室目标基因克隆的三大战略：1.利用PCR技术或化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆、表达；2.构建感兴趣的生物个体的基因组文库或cDNA文库；3.利用基因差异表达获得目的基因。基因的分离和获得的常用方法一、基因分离的物理方法二、鸟枪法(Shotgun)又称霰弹法三、cDNA文库的建立与基因的分离四、基因组文库法五、基因的化学合成六、聚合酶链反应技术（PCR）一、基因分离的物理方法根据DNA分子的两条链存在着G≡C，A=T碱基配对。如DNA分子中某段的G≡C碱基对含量高，则其热稳定性就高，其

2、溶解温度（Tm）就高。这样，人们通过控制溶解温度使富A=T区解链变性，而富G≡C区仍维持双链。当利用单链核酸酶S，酶去除解开的单链部分，得到富G≡C区的DNA片段。二、鸟枪法(Shotgun)又称霰弹法用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度上与一般基因大小相当的DNA片段（1000bp），然后，将这些片段混合物随机地重组入适当的载体，转化后在受体菌（如：E.Coli）中进行扩增，再用适当的筛选方法筛选出你所要的基因。优点：操作简单，命中率较高。缺点：盲目性大，阳性片段不一定正好是基因，样本多，可能会漏。鸟枪法克隆目的基因的基本战

3、略1、随机酶切成基因相当大小的片段（约1000bp)；2、重组入适当载体（质粒）；3、转化进宿主菌（E.coli)，扩增；4、筛选出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离+三、基因文库法cDNA文库（cDNAlibrary)则是将某生物特定的组织器官或发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的产物。基因组文库(Genomiclibrary)是将某一生物基因组DNA全部克隆后获得的重组子群体的总称。基因文库(Genelibrary)是通过克隆的方

4、法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体。构建基因文库的意义1.通过基因文库的构建贮存和扩增特定生物基因组的全部或部分片段，保存物种遗传种质。2.从基因文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因。3.构建基因文库是研究基因本身的需要,如基因结构的分析、基因表达和调控的研究等。基因组文库的类型:质粒文库、噬菌体载体文库、粘粒文库、细菌人工染色体文库和酵母人工染色体文库。几个物种基因组大小及基因数目物种基因组大小（106bp）基因数目衣原体（M.genitalium）0.58470大肠杆菌（E.coli

5、）4.64288酵母（S.cerevisiae）13.56034果蝇（D.melanogaster）16513600线虫（C.elegans）9719099拟南芥（A.thaliana）13525500人（H.sapines）330035000构建基因组文库应满足的条件基因组文库的完备性：是从基因组文库中筛选出含有某一目的基因的重组克隆的概率。基因组文库的大小:1）基因组的大小；2）克隆片断的长度；3）从中分离特定基因的置信度。N=1n(1一P)／ln[1-L/G]式中P为期望概率，L为单个重组体的DNA片段的长度，G为基因组DNA的总长度。

6、N是所需要的重组体数目例如，某一哺乳动物基因组G=3x109bp，以17kb的随机片段克隆构建的文库中，使任一给定DNA序列达99％的概率出现，则：N＝ln(1-0.99)／ln[1一(17x103／3x109)=8.1x105如果克隆片断长为20kb，则N=6.5X105果蝇的基因组约1.5X108bp，以20kb克隆时，N=4X105基因组文库的构建(一）基因组DNA的分离制备原核细胞的基因组包括其拟核的DNA和附加的遗传体系如质粒DNA，真核细胞的基因组包括其核基因组及细胞器如线粒体和叶绿体的DNA。质量必须满足：1.结构具有相对完整性

7、；2.尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3.保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及离子等。（二）基因组DNA的片段化1.限制性内切酶对DNA分子的酶解两种方式：DNA完全酶解和DNA不完全酶解。DNA完全酶解人基因组DNA酶解琼脂糖凝胶M：DNA分子marker；1：未酶解的人基因组DNA；2：RsaI完全酶解后的DNAM12DNA不完全酶解人基因组DNA以Sau3A酶进行的不完全酶解M：DNA分子marker；1：未酶解的基因组DNA；2-10：显示酶解的程度逐步提高M12345678910用DNA的随机片断克隆

8、法来：机械剪切和部分酶切1)  随机片断的重叠性，能够沿某一克隆“步查”直至将整个染色体衔接起来（利用片段间重叠区的信息，可以将独立的重组子加以衔接，最后整个染色体