基因工程2—工具酶中国药科大学生物工程所有

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1、基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。第二节基因工程的工具酶自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获

2、得了最好的基因工程工具。随着越来越多的酶分子被发现，许多厂商已将其克隆并开发成产品，工具酶的数量和用途不断增加，不仅简化了分子克隆的操作，而且拓宽了研究领域。本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。基因工程工具酶限制性内切酶连接酶DNA聚合酶DNA修饰酶RNA聚合酶磷酸激酶和磷酸酶核酸酶一、细菌的限制—修饰作用和限制性内切酶的发现第一节限制性核酸内切酶①50年代后Luria和Human(1952)Bertani和Weigle(1953)发现细菌的“限制”现象.1、细胞的限制—修饰作用Phageλ（k）感染E.col

3、ik不感染E.coliB(E.coliB限制λ（k）)②仍有少量λ(K)可在E.coliB中生存，是因E.coliB对λ(K)进行了修饰。E.coliB修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰？①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在Phage入的DNA上。②1965年，Arber发现修饰与λ的降解有关，提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统(R-MRestriction-modificationsystem)。R-M系

4、统是细菌安内御外的积极措施。细菌的限制—修饰系统即限制性内切酶和与其对应的甲基化酶系统，称R-Msystem限制性内切酶识别特异的DNA序列并打断DNA，同时对应的甲基化酶能把该段特异的序列甲基化，使得限制性内切酶无法识别。这种系统在细菌中起到了免疫的作用，即外来入侵的DNA在限制性内切酶的作用下被水解，而细菌自身的DNA在甲基化酶的作用下被保护起来。细菌的限制和修饰现象①1968年Linn和Arber从E.coliB中发现限制酶,M.Meselson和R.yuan从E.coliK中分离到另一限制性的内切酶。19

5、70年Smith(美)在流感嗜血杆菌又发现另一限制酶即限制酶Ⅱ。②限制酶的功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。③1978年W.Arber、H.O.Smith(美)，Nathans(美)因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖。限制性内切酶的发现二、限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。（Restrictionendonuclease）2.性质内切酶。原核生物。即在核酸分子链的内部制造切口的酶。自我保护作用。3.功

6、能细菌的限制和修饰系统（R/M体系）1.来源限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。（1）限制（Restriction）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification）①Dam甲基化酶(Mec甲基化酶)GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：三、限制性内切酶的命名1.用属名的第一个字母和种名的头两

7、个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。4.限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。2.用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoRI，EcoRV。EcoRIEscherichia属名Coli种

8、类Ry13株系编号若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。I型限制性内切酶目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。四、限制性内切酶的类型II类限制性内切酶III类限制性内切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。（1）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I类限制性内切酶如