目的基因的克隆转化及重组子筛选.doc

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1、目的基因的克隆、转化及重组子筛选一．实验目的：(1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。(2)学习DNA连接的有关技术。(3)掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。(4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。(5)掌握质粒提取的基本方法。(6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。二．实验原理：(1)cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为T-A克隆。可用于PCR产物的克隆和测序。

2、(2)感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。(3)蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。诱导物IPTG和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产

3、物。可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。三．实验材料：大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/LCaCl2DNA割胶回收试剂盒，试管，Amp/IPTG/X-Gal，三角玻璃棒，玻璃珠，牙签，1µlpMD19-TVector、质粒提取试剂盒。四．实验步骤、现象、结果及分析：(1)cDNA电泳及胶回收1.提取总RNA，反转录cDNA，用设计好的引物扩增出不同的目的片段。取目的基因产物进行琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。2.把所割胶放入1.5mlEP管，称重如下表一。表一：cDNA琼脂糖凝

4、胶重量空管2管3管重量（g）0.90451.22801.2961净重（g）0.32350.39163.按1g/1ml的量，大致各加入400µlBindingBuffer，65℃水浴7min；（每隔2－3min，摇一下）；4.把溶液转移至spin-column，10000g离心1min，倒出套管内残液；5.在柱子中加入300µlBindingbuffer，10000g离心1min，倒出套管内残液；6.在柱子中加入700ul的SPW溶液，放置3min，10000g离心1min，去残液；7.10000g离心1min（去乙醇）；8.把柱子放入干净的1.

5、5mlEP管。加ElutionBuffer20µl。室温放置1min，10000g离心1min。79.检测DNA的纯度和浓度，如下表二所示。选取质量好的2号组进行接下来的连接转化。表二：cDNA吸光度测定2组3组A260/A2801.8641.867浓度（ng/µl)146.718128.242（2）感受态细胞制备1.从新鲜培养的LB平板上挑单个DH5a大菌落接种到3mlLB培养液中，37℃剧烈振荡培养过夜（教师准备）。2.取过夜培养的大肠杆菌DH5a按1：50取1ml菌液接种到50mlLB培养基中，37℃振荡培养，1hr后用分光光度计测其OD

6、值为0.182，1.5hr后再测其OD值，为0.304，到达其对数生长期（细菌对数生长期OD600为0.2-0.4）。3.分别取1ml菌液至1.5ml离心管中标记为1号、2号、3号，培养物冰上放置10min，5000r/min，离心2min，用枪头吸取废液，弃去，收集底部菌体。4.分别加入500µl预冷的0.1mol/LCaCl2，用枪头吹散，使菌体悬浮于预冷的CaCl2中，冰上放置10分钟。5.离心机5000r/min，离心2min，用枪头吸取弃上清，分别加入100µl预冷的0.1mol/LCaCl2，小心用枪头吹散，0℃保存3hr。（3）连

7、接和转化组别实验组正对照组负对照组操作连接：从2号胶回收DNAEP管中取4µl，加入1µlpMD19-TVector、5µlSolutionⅠ组成10µl连接反应体系，在16℃下进行连接反应；转化：30min后加入1号100µl感受态细胞EP管中，以手指轻轻触碰混匀，冰中放置30min进行转化，接着42℃热激45sec，再在冰中放置1min，最后加入390µlLB液体培养基于37℃振荡培养50min。取1µl(5ng/µl)质粒加入2号100µl感受态细胞EP管中。无需取任何物质加入3号100µl感受态细胞EP管中。样品组-100µl：从上述5

8、00µl体系中取100µl加入LB/Amp/IPTG/X-Gal平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀，于37℃倒置、过夜培养。样品组-200µl：从上述50