目的基因与克隆载体的体外重组

《目的基因与克隆载体的体外重组》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第五章目的基因与载体的体外重组基因工程的操作过程切接转增检连接时考虑因素实验步骤尽量简单易行连接形成的节点序列应能被重新切割对转录、转译中密码阅读不发生干扰粘性末端连接平末端连接末端延伸连接：连接方式同聚物加尾加人工接头加DNA衔接物粘性末端连接—单酶切产生的粘性末端的连接（同种酶）5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'退火GCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAG5'GCTTAA

2、5'5'AATTCG5'5'GAATTCCTTAAG5'EcoRI粘性末端连接—单酶切产生的粘性末端的连接（同尾酶）BamHI5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'TACTAG5'5'GATCAT5'退火GCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT5'TGATCAACTAGT5'BclITGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT粘性末端连接—双酶切产生的粘性末端的连接5'5'GAATTCCTTAAGGGACTTCCTGAAEcoR

3、I5'GCCTGAAATTCG5'退火GCCTGAAATTCG5'GCTTAA5'GACTTAT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'5'GGACTTCCTGAA5'GCTTAA5'5'GACTTA5'5'GAATTCCTTAAGEcoRIGGACTTCCTGAABamⅢBamⅢ平末端连接HpaI5'5'GTTAACCAATTGGTTAACCAATTG5'GTTCAAAACTTG5'5'CCCGGG5'GGGCCC3'T4-DNAligaseCCCAACGGGTTG5'5'GTTGGGCAACCC5'CCCGGGGGGCCC5'StuI3'平末端连接--不同粘性末端的平端连接

4、BamHI5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'CTGCAG5'GACGTC3'T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC5'CTGCAGGACGTC5'PstI3'T4-DNApol切平5'CG5'GCKlenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'CTAGGCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC粘性末端的更换BamHI5'5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseKlenow补平GATCC5'G5'GCCTAG5'5'5'GGATCCCTAG5'GATCCCT

5、AGG5'5'GGATCCTGCAGGATCCCCTAGGACGTCCTAGG5'5'PstICTGCAGGACGTCPstIlinker末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化dNTP随机加于DNA分子的3‘-OH端5‘p3‘HOOH3‘p5‘TDTMg2+dATPAAAAAAAAAAAAOH3‘5‘p3‘HOp5‘同聚物尾巴Poly（dA）末端延伸连接—同聚物加尾C3'GG5'G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA3'GG3'AAAAAAAAAAC5'5'G

6、TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3'5'5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT末端延伸连接—同聚物加尾（平齐末端）末端延伸连接—同聚物加尾（3‘突出末端）CTGCA3'GG3'ACGTC5'GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'CCCCCCGT

7、ACGCTGCAGGGGGG3'GG3'GGGGGGACGTC5'5'GCATGCCCCCCGCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'5'GCATGCCCCCCGCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'5'GCATGCCCCCC