基因操作与克隆载体

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1、DNA的损伤原因：1.DNA分子的自发性损伤(1)DNA复制中的错误(2)DNA的自发性化学变化a.碱基的异构互变b.碱基的脱氨基作用c.脱嘌呤与脱嘧啶d.碱基修饰与链断裂2.物理因素引起的DNA损伤(1)紫外线引起的DNA损伤(2)电离辐射引起的DNA损伤a.碱基变化b.脱氧核糖变化、c.DNA链断裂d.交联复习3.化学因素引起的DNA损伤(1)烷化剂对DNA的损伤a.碱基烷基化b.碱基脱落c.断链d.交联(2)碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤复习分子改变类型：点突变(pointmutation)：指DNA分子上一个碱基的变异（置换）。(1)、转换(transition)：发生在同

2、型碱基之间的置换(2)、颠换(transversion)：发生在异型碱基之间的置换突变效应：同义突变错义突变无义突变终止密码突变抑制基因突变移码突变DNA的修复系统(一)回复修复1.光修复2.单链断裂的重接3.碱基的直接插入4.烷基的转移(二)切除修复(excisionrepair)(三)重组修复(recombinationalrepair)(四)SOS修复复习1．转座子的分类和结构特征a.简单转座子转座子（transposon，Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（insertionsequence，IS），它们

3、是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。IS序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。b.复合式转座子（compositetransposon）是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。重组与转座2、转座作用的机制转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的（3-12bp

4、）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。不同转座子的靶序列长度不同，但对于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度都是一样的，如IS1两翼总有9个碱基对的靶序列，而Tn3两端总有5bp的靶序列。转座可被分为复制性和非复制性两大类。在复制性转座中，所移动和转位的是原转座子的拷贝。转座酶（transposase）和解离酶（resolvase）分别作用于原始转座子和复制转座子。TnA类转座主要是这种形式。在非复制性转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以这种方式进行转座。重组与转座转座子的应用3.反转录转座子(ret

5、rotransposon或retroposon)指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件。这样的转座过程称为反转座作用(retrotrans—position)。4.转座作用的遗传学效应①转座引起插入突变;②转座产生新的基因;③转座产生的染色体畸变;④转座引起的生物进化.目前转座子元件是植物分子生物学操作和植物基因工程中分离克隆基因和研究基因功能最有力的工具之一，其中的一大类—反转录转座子具有分布广、异源转座高和受组织培养诱导激活等优势。此外通过对现有转座元件的改造以及转座元件作为载体改造的工具，也将大大加速植物基因和功能序列的分离与研究，如利用转座子元件构建启动子。二

6、、限制性内切酶1、限制性内切酶的定义•是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部分，具有识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列并由此切割DNA双链结构的酶统称为限制性内切酶。2、限制性内切酶的发现•Luria和Human发现细菌能将外来的DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不被外来噬菌体所感染，而其自身的DNA由于被一种特殊的酶所修饰（甲基化）而得以保护，这种现象叫做限制修饰。二、限制性内切酶Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种酶，能够特异性的切割DNA，这个酶被命名为HindI,这是第一个分离到的限制性内切核酸酶。二、限制性内切酶二、限制性内切酶3、限制性核酸内切

7、酶的命名•按酶来源菌的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。二、限制性内切酶4、限制性内切酶的类型限制性内切酶可分为三大类型：•类型I和类型III：由于识别位点并非严格专一，很少被应用。•类型II：是DNA重组技术最