菌落pcr筛选阳性重组子

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1、实验十菌落PCR筛选阳性重组子【实验目的】学习利用菌落PCR技术筛选阳性重组子的方法【实验原理】细菌细胞内的重组DNA以裸露状态存在。在高温条件下，细菌细胞破裂，细胞内DNA暴露并因高温的作用而变性成为单链状态的DNA，此时该DNA可作为模板用于PCR，进而检测该DNA中是否含有重组的外源DNA序列。【仪器、材料与试剂】1仪器生化培养箱，超净工作台，离心机，PCR仪，电泳仪，电泳槽，连续可调移液器，凝胶成像系统2材料含待检测菌的阳性筛选平板，PCR试剂盒，引物1（primer1）和引物2（primer2），PCR管，移液器枪头，ddH

2、2O，电泳级琼脂糖，Tris碱，硼酸。3试剂PCR试剂盒：10XPCRbuffer，MgCL2或MgSO4，dNTPs，DNA聚合酶；primer1和primer2：均配成10μmol的使用液；DNAMarker：根据PCR产物大小确定。【实验步骤】1配制25μL的PCR反应体系10×buffer2.5μLMgCL2或MgSO41.5～2.5μL（若buffer里有，则可不加或少加）dNTPs（2µmol）2.5μLprimer1(10µmol)1μLprimer2(10µmol)1μLTaq酶（或其他用于PCR扩增的DNA聚合酶）1

3、UddH2O补至25μL最后用移液器挑取筛选平板中的待检测菌落，放入上述反应体系中。2PCR程序配制好反应体系后，将其放入PCR仪中。然后根据最初设计引物时的相关数据，设定PCR程序中的每一步的反应条件。通常设计的反应条件如下：94℃预变性3～5min；94℃变性30sec～1min50～60℃退火1min30～35个循环72℃延伸2min72℃最终延伸8～10min设定好程序后，即可开始运行程序，进行PCR。3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测见实验六PCR完成后，取5～8μLPCR产物与适宜的上样缓冲液（loadingbuffer）混

4、匀后，加样电泳。待电泳完成后，将凝胶置于凝胶成像系统中观察结果。【注意事项】1配制PCR反应所用PCR管及移液器枪头要洁净、无菌，反应体系配制时要仔细，防止液体飞溅。2要选取清晰、散落的菌落进行挑菌，防止沾染其他菌落或杂菌。【思考题】1菌落PCR扩增时应注意哪些问题？2菌落PCR扩增鉴定阳性重组子的依据是什么？