菌落pcr和质粒pcr对转化菌的筛选

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1、菌落PCR和质粒PCR对转化菌的筛选文章来源：　　　　2006-7-1910:16:32菌落PCR和质粒PCR对转化菌的筛选免疫学杂志2000年第2期第16卷技术与方法作者：沈关心　朱慧芬　张悦　王硕　朱志刚　周春单位：同济医科大学免疫学教研室，湖北武汉430030关键词：菌落PCR；质粒PCR；序列分析　　摘　要：目的为建立简便、可靠转化菌的筛选方法。方法应用菌落PCR和重组质粒PCR方法对转化菌进行筛选和DNA序列分析。克隆载体和表达载体筛选及鉴定采用与载体多克隆插入伍点序列互补的通用引物或免疫球蛋白家族特异性引物。阳性菌落和质粒PCR产

2、物通过酶消化后作为模板进行自动测序。结果菌落PCR和质粒PCR技术可作为基因克隆筛选和鉴定的方法，结论菌落PCR和质粒PCR方法简便、快速、可靠，其产物可作为模板直接用于序列分析。　　分类号：Q78；Q782；Q783　文献标识码：A　　文章编号：1090-8861(2000)02-0151-03SereeningoftransfectedbacteriabybacteriacoloniesPCRandplas-midPCRSHENGuan-xin,ZHUHui-fen,ZHANGYue,WANGShou,ZHUChun(Department

3、ofImmunology,TongjiMedicalUniversity，Wuhan430030，China)　　Abstract：Objectivewehavedevelopedaprocedurethatallowsrapidscreeningoftransfectedbacteriacoloniesanddi-rectsequencingofbacteriacoloniesaswellasplasmidpCR-products．Methodsinthefirststepthemultiplecloningsitescon-taining

4、thesequencesofinterestareamplifiedbybacteriacoloniesPCRandplasmidPCRusinglacZspecificprimersinclonedvectors．ForscreeningofexpressionvectorsofVHandVLofmonoclonalantibodieswehaveusedfamilyspecificprimers．ColoniespCR-andplasmidPCRproductsarepurifiedenzymaticalyandareusedastemp

5、latesindye-primerordye-terminatorsequencing.ResultsTheprocedureallowsfastsequencingofalargenumbersofsampleswithminimalon-handstimeandminimalneedforprecipitation/centrifugationsteps．Usingthismethod，weroutinelycanread600ormorenucleotidesfor120PCR-productsonastandardaBI373Aseq

6、uencer．ConclusionsdespiteofthefactthatourmethodsrequiresanadditionalPCR-step,itsfaster，cheaperandmorereliablethanthestandardmethodusinghighlypuuifiedplasmidDNA．　　Keywords：bacteriacolonies；PCR；plasmidpCR；sequences　　PCR产物作为模型直接测序，具有快速、简便等优点。本研究采用与载体插入位点两端序列互补的通用引物(LacZfor和Lac

7、Zback)，用克隆载体转染菌的筛选与鉴定。采用目的基因5'端和3'端特异性引物，用于表达载体转染菌的筛选和鉴定。并将9株抗不同抗原单克隆抗体可变区基因120个阳性质粒PCR和菌落PCR产物作为DNA测序模板，进行自动测序，现报道如下。1.2.1克隆载体的菌落或质粒PCR引物：由PerkinElmer公司合成。　　LacZback：5’-GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGG-3‘；LacZfor：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACG—3’。　　1.2．2表达载体的菌落或质粒PCR引物：鼠免疫球蛋白家族特异性引物

8、[1～5]，由PerkinElmer公司合成。　　1.2．3测序引物：M13／pUC(-29)back：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'；M13／pU