菌落PCR步骤讲解学习.docx

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1、菌落PCR步骤精品文档●菌落PCR步骤1、PCR扩增的DNA模板用无菌牙签挑取单个菌落到0.2mLPCR管中，加入10μL无菌1×TE缓冲液混匀(可用戴手套的手指弹击离心管)，标记，盖紧，100℃煮沸5min，-20℃冷冻5min(循环2次)，5000r/min离心1min，吸取8μL上清液作为PCR扩增的DNA模板。2、采用50µL反应体系50µL反应体系体系组分添加量备注DNA模板8μL10×PCR缓冲液(含Mg2+1.5mmol)5µLdNTP(10mmol/L)1µL上游引物(25µmol/L)2µL

2、下游引物(25µmol/L)2µL终浓度为1µmol/LTaq酶(每微升含2单位)2µL去离子水30µL将引物稀释成100µM的储备液。3、PCR参数：95℃预变性5min；→主循环94℃30s,→54℃30s,→72℃30s,→循环30次；→终延伸72℃7min；→4℃保存。4、电泳：用1×TAE缓冲液配制质量浓度为0.1g/L的琼脂糖凝胶，加EB（荧光素，溴化乙锭）至终浓度为0.5µg/ml。将PCR扩增产物与6倍载样缓冲液混合，每个样品加样10µL，10V/cm电泳40min，用紫外凝胶成像系统拍摄电泳

3、结果。●编号1、鉴定值：00164，鲶鱼爱德华氏菌（00160）。1、脾2、脾。2、鉴定值：02164，猪霍乱沙门氏菌（02165）。1、肠1、肝2、心2、肝。3、鉴定值：00564，发光致病杆菌（00600）。2、肠。4、鉴定值：02364，猪霍乱沙门氏菌（02364）。1、心。5、霍乱弧菌。1、鳃。●培养基配方营养琼脂（NA）用途：细菌计数、不含糖，可作血琼脂基础和传代用（GB标准）。配方：（g∕L）蛋白胨10.0g牛肉粉3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g磷酸二氢钾1.0gPH值7.3±0.1收集于网络

4、，如有侵权请联系管理员删除精品文档原理蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素和碳源；氯化钠能维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂。普通肉汤培养基用途：用于金黄色葡萄球菌的增菌培养（SN标准）。配方：（g∕L）蛋白胨20.0g牛肉粉5.0g氯化钠5.0g磷酸二氢钾1.0gPH值7.5±0.1(25℃)原理蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素和碳源；氯化钠能维持均衡的渗透压。收集于网络，如有侵权请联系管理员删除