单菌落pcr在发夹rna重组克隆鉴定中的应用

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1、第53卷第1期湖北农业科学Vol．53No.1湖北农业科学2014年2014年1月HubeiAgriculturalSciencesJan．，2014单菌落PCR在发夹RNA重组克隆鉴定中的应用李旭艳，恽冬泽，邵淑丽（齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江齐齐哈尔161006）摘要：以单菌落为模板进行PCR扩增，直接筛选插有发夹RNA（SmallhairpinRNA，shRNA）干扰片段的重组阳性克隆。以圆滑单菌落为PCR模板，采用载体通用引物直接扩增目的片段，质粒测序验证PCR结果的正确性。结果表明，在筛选的6个菌落中均扩增出324bp的目的条带，进一步进行测序分析鉴定，证实了菌落PCR阳性

2、克隆含有发夹RNA干扰片段。单菌落PCR是一种简便、快速、可靠、有效筛选重组阳性克隆的方法。关键词：单菌落PCR；重组克隆；发夹RNA中图分类号：Q781；S961.6文献标识码：A文章编号：0439－8114（2014）01－0220-02ApplicationofIndividualBacterialColoniesPCRinScreeningshRNARecombinantCloneLIXu－yan，YUNDong－ze，SHAOShu－li（CollegeofLifeScienceandAgro-forestry，QiqiharUniversity，Qiqihar161006，Heil

3、ongjiang，China）Abstract：TheindividualbacterialcolonieswereadoptedfortemplatesofPCRtoscreenrecombinantclonecarryingsmallhairpinRNA．ThePCRamplificationwithindividualbacterialcoloniesanduniversalprimerwasdevelopedtodetecttargetingfragment．Thepositivecolonieswerefurtherconfirmedbysequencing．Resultsshowe

4、dthatamongthesixclones，thepositivebandinthesizeof324bpweredetectedonagarosegel．DNAsequencingconfirmedthatshRNAtemplatewasclonedintoplasmidvectorsuccessfully．IndividualbacterialcolonyPCRisasimple，rapid，reliableandefficientmethodforscreeningtherecombinantclones．Keywords：individualbacterialcoloniesPCR；

5、recombinantclone；shRNA在基因重组试验中，筛选含有插入目的基因片1材料与方法段的重组阳性克隆常用的方法有快提质粒、酶切法、互补插入失活法及杂交筛选法等［1］，这些方法各1．1材料有其优缺点。T4DNAligase、BamHⅠ、HindⅢ购自TOYOBO近年来，由于聚合酶链反应技术（Polymerase公司，E．coliDH5α、氨苄青霉素（Amp）、PCR试剂盒、pSilencer3．1－h1neo（AmpRchainreaction，PCR）具有简便、快速及灵敏等特点，）载体由鼎国生物技研究者建立了PCR鉴定阳性克隆的方法，通常以提术有限公司提供。取的质粒或者裂解的菌液作

6、为PCR的模板［2，3］，可shRNA模板为F，5′－GATCCGAAGGAAAAGAA以获得良好的筛选效率。为进一步简化制备模板的ACCAACTTTCAAGAGAAGTTGGTTTCTTTTCCTTCT步骤，节约时间，本试验以单个转化菌体为模板，不TTTTTGGAAA－3′；R，5′－AGCTTTTCCAAAAAAGAA经过任何处理，采用载体通用引物直接扩增目的片GGAAAAGAAACCAACTTCTCTTGAAAGTTGGTTTC段，来初步鉴定和筛选阳性转化菌，为该方法的使TTTTCCTTCG－3′，由北京奥科生物技术有限公司合用提供参考。成，退火为双链。PCR引物为F，5′－GTTTTC

7、CCAGT收稿日期：2013－05－10基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（C200624）；黑龙江省教育厅科学技术项目（11511447；12511611）作者简介：李旭艳（1982－），女，山东济南人，讲师，主要从事遗传学方面的研究，（电话）0452－2782835（电子信箱）lxy0702＠126．com；通讯作者，邵淑丽，教授，主要从事分子生物学方面的研究，（电话）0452－2738219