PCR技术在微生物鉴定中的应用.pdf

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1、昆虫分子生物学课程论文学院:植物保护学院课程:昆虫分子生物学学号:姓名:任课教师:职称:教授成绩:2015年8月29日PCR技术在微生物鉴定中的应用摘要随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，特别是在微生物检测中的应用。细菌16SrDNA测序鉴定需进行DNA扩增、测序和分析，其设备条件和实验成本比传统的表型鉴定更高，从鉴定的准确率来看，其具有的优势毋庸置疑。同时，随着微生物检测技术的不断发展,BOX-PCR技术在微生物的多样性研究中也已得到应用。使用真菌ITS区域序列通用引

2、物PCR扩增和DNA序列测定的方法，简便快速、成本低稳定性好、结果可靠，适合实验室常规使用，可用于常见的和疑难真菌菌种快速鉴定。关键词PCR；16SrDNA；BOX-PCR；ITS；细菌；真菌PCR(polymerasechainreaction,PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成扩增特定DNA片段的方法，1985年美国Karray等学者首创了PCR技术并由美国Cetus公[1]司开发研制。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖、

3、环境科学、食品安全等领域，包括基因的克隆、修饰、改建、构建cDNA文库、遗传病传染病的诊断、法医学鉴定、物种起源、生物进化分析、流行病学调查等。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，[2-3]因而其应用领域也在不断延伸。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又[4]衍生出了许多技术，如多重PCR（mutiplex，PCR）技术、实时荧光定量PCR（real-time[5][6]fluorescentquantitativePCR,FQ-PCR）技术、单分子PCR

4、技术等。1PCR技术原理PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列，人工合成与该DNA2条链末端互补的2段寡核苷酸，引物在体外将待检DNA序列模板在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94℃的条件下变性解链；第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55℃退火；第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’~3’方

5、向延伸与模板互补的[7]新链。经过这个循环后合成了新链可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中扩增产物的量，以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩[1]增l00万~200万倍。2PCR技术在细菌鉴定中的应用细菌检测包括传统的形态学检查、分离培养、生化鉴定、免疫分析等多种方法，其中细菌的分离培养最为关键，但对苛养菌及生长缓慢的细菌分离培养很棘手。近年来各种基因诊断技术在细菌检测中不断开发利用，尤其是基于聚合酶链反应（PCR）的基因诊断技术发挥着越来越重要的作用

6、。2.116SrDNA在细菌鉴定中的应用16SrDNA是编码原核生物16SrRNA的基因,长度约1500bp,存在于所有细菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体和放线菌等原核生物的基因组中，由多个保守区（conservedregion）和与之相间的多个可变区(variableregion)组成保守区，为所有细菌共有，细[8]菌之间无显著差异；可变区在不同细菌之间存在一定的差异，具有细菌属或种特异性。PCR扩增16SrDNA包含两层含义:在保守区设计PCR通用引物，理论上可将存在于待测标本中的各种细菌

7、都扩增出来；若选择可变区设计PCR特异性引物，则可将标本中的细菌鉴[9]定到属种乃至菌株水平，因此16SrDNA已成为细菌鉴别与分类研究中较理想的靶序列。细菌16SrDNA中含有９个可变区，命名为V1-V9区，确定某个可变区内具有细菌种特异性的序列就可能获得细菌实验室诊断的有用靶点，除V2、V3、V4区稍长外，其他各[10]高变区序列都很短，没有哪个高变区能区分所有细菌。目前，已有很多基于16SrDNA全长或部分序列的应用研究：王永智等在对20余种致病菌进行16SrDNA多序列比对的基[11]础上

8、，设计扩增细菌16SrDNA的荧光定量PCR通用引物，检测血液细菌污染模拟标本；应燕玲等通过13种标准菌株建立了一种基于16SrDNA全长特异性扩增和测序的方法，利[12]用与GeneBank数据库比对，成功鉴定出血制品污染的11种未知细菌；美国Maastricht大学医学中心研究的实时定量16SrDNAPCR扩增系统，利用通用探针外加种或属特异性探针的多探针法，能在2h内对血液感染中常见的几种细菌，包括革兰阴性的假单胞菌、[13]大肠埃希菌及革兰阳性的葡萄球菌、肠球菌、链球菌等进