《色谱分离》PPT课件

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1、第四节离子交换色谱1．离子交换层析的原理离子交换层析(Ionexchangechromatography，IEC)是利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的不同而发生差速迁移，从而实现溶质分离的洗脱层析法。阴离子交换基：DEAE(二乙胺乙基，通用范围：pH≤8.6），QAB(季铵乙基）；阳离子交换基：CM(羧甲基，适用范围pH＞4)，P(磷酸基)和SP(磺丙基)。各种凝胶过滤介质键合上述离于交换基，即可制备相应的离子交换剂。常用于制备离子交换剂的介质有Sephadex、Sepharose、TSKgetPW、Toyopearl、Bio-GelA和纤维素等。原理:根

2、据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。离子交换剂分离蛋白质的过程平衡吸附去吸附分离结束再生+低盐高盐利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Ion-exchangechromatography2．离子交换层析的操作离子交换层析的装置主要包括蠕动泵、离子交换层析柱、紫外检测器及部分收集器等。进行离子交换层析时，先将树脂用展开剂处理，使树脂层析剂转变成展开剂离子的型式；然后将溶解在少量溶剂（通常为展开剂）中的试样加到层析柱的上部，再通入展开剂展开，流出液分步收集，测定其含量。在分

3、离制备中，根据检测结果，分段合并各步收集液，并进行浓缩提取。IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用：流动相离子强度线性增大的线性梯度洗脱法(1ineargradiente1ution)或离子强度阶跃增大的逐次洗脱法(stepwiseelution)。在线性梯度洗脱和逐次洗脱过程中，IEC柱内溶质区带后部的离子强度高于前部，因此区带后部的移动速度高于前部，溶质在洗脱过程中得到浓缩。GFC之外的层析操作多采用线性梯度洗脱法或逐次洗脱法，只是流动相组成的变化情况各不相同。线性梯度洗脱法的优点是流动相离子强度(盐浓度)连续增大，缺点是需要特殊的调配浓度梯度的设备。逐次洗脱法的优点是利用切换不同盐浓

4、度的流动相溶液进行洗脱，不需要特殊梯度设备，操作简便。缺点是因为流动相浓度不连续变化，容易出现干扰峰。此外，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象，因此洗脱操作参数(如盐浓度，体积)的设计较困难。综合上述两种洗脱法的特点，在实际层析操作中，如果料液组成未知，一般应首先采用线性梯度洗脱法，确定各种组分的分配特性以及层析操作的条件。选择合适的离子交换剂是操作关键，另外离子交换层析缓冲液的选择也很重要。溶解样品的初始缓冲液离子强度要低，层析展开用的洗脱剂离子强度可升高。使用梯度洗脱时，离子强度逐渐增加。阳离子交换剂的洗脱pH由低到高，阴离子交换剂的洗脱pH由高到低。新的离子交换剂在初次使用前，常需预处理

5、，离子交换剂使用过后，要再生处理。胶体再生蛋白质全部溶離出來后，交換介質要经过再生(regeneration)后，才能再次使用。(2)以1~2MNaCl即可洗去杂蛋白，彻底清洗可用0.1MNaOH流洗；阴离子子交換介质可用1M醋酸纳(pH3.0)洗1.5倍体积；再以缓冲溶液平衡完全，才能再度使用。(3)可测流出液的pH，是否与加入的缓冲液一样。也可把膠体取出，在燒杯或漏斗中澈底清洗。大多数失败是因于再生不良！3离子交换层析的应用及特点如果说GFC主要用于初步纯化和中后期的脱盐，则IEC是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要纯化手段。这主要是由于IEC基于离于交换的原理分离纯化生物产物，不仅具有

6、通用性而且选择性远高于GFC。激素多肽的IEC分离EcoliRNA的IEC分离归纳而言，IEC具有如下的特点：①料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流速下操作；②应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长较短；③产品回收率高；④商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格也远低于亲和吸附剂。但是，IEC的操作变量远多于GFC，影响分离效果的因素非常复杂。这种复杂性给目标产物的选择性高度纯化带来了机遇，同时也增加了过程设计和规模放大的难度。小型层析柱的实验数据一般不能直接用于规模(包括柱体积和处理量)放大，必须实施必要的探索性实验。离子交换是可逆的等当量交换反应。传统的离子交

7、换应用时采用固定床实现的，在交换过程中树脂床将分为三段，即饱和区、活性区（传质区）和新鲜树脂区。随着交换进行，传质区不断下移直至底部交换完全。整个过程只有传质区处于工作状态，饱和区和新鲜树脂区闲置，因此树脂利用率低。为了提高树脂利用率，把传质区进行抽象分割成几个小单元，一旦上面的小单元饱和后就移出来进行洗水及再生操作，处理用的新鲜树脂单元又回到传质区底部循环使用，这样大大提高树脂的利用率。连续离交为了能够实现树脂单元自动