《色谱分离技术》PPT课件

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1、第7章色谱分离技术7.1基本原理7.2分配色谱7.3凝胶过滤7.4离子交换7.5亲和色谱7.1基本原理7.1.1概述1903年俄国植物学家茨维持(Цвет，Tswet)在填充碳酸钙柱中用以石油醚冲洗植物色素萃取物，得到各色区带;1931年氧化铝柱中胡萝卜素两种同分异构体的分离，表现出极高的分辨率;1944年出现纸层析;1950年代气相色谱出现，色谱分离的仪器化1960年代高效液相色谱的发展，高效固定相填料获得突破进展随着生物技术的发展，色谱分离已成为生物产品高度纯化最有效的的方法之一。从多数生物产品纯化工艺来讲，色谱分离是产品包装前的最后纯化工序。色谱分离基本特点(1)分离效率

2、高是所有分离纯化技术中最高的(不计电泳)。若用理论塔板数来表示柱效率，每米柱长可达103～105块塔板。通常色谱柱长一般只有几厘米至几十厘米。(2)应用范围广从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳定的化合物，都可用色谱法分离。(3)选择性强色谱分离有很强的选择性,可通过多种途径选择不同的操作参数，以适应各种不同样品的分离要求。(4)高灵敏度的在线检测(5)快速分离高效细颗粒固定相载体和高压液相色谱分离技术的采用，保证在高分离效率前提下的高分离速率，可以提高单位时间的产量。(6)过程自动化操作色谱/层析/色层机理：利用多组分

3、混合物中各组分物理、化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中。当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理、化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离、纯化。吸附色谱是指混合物随流动相通过固定相吸附剂时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离。7.1.2色谱（Chromatography)分离的分类7.1.2.1按分离机理不同分类(一)吸附色谱分离(AdsorptionChromatography，AC)吸附色谱是各种色谱分离技术中应用最早的一类，传统吸附色谱以各种无机材料为吸附剂。新型吸附色谱技术，如疏水作用色谱、金属整合作用色谱和共价作用色谱等。分

4、配色谱流动相和固定相都是液体，利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。操作方法有两种：一种是固定相是将与流动相互不相溶的液体涂渍到载体上形成的；另一种是逆流分配法，固定相(重相)和流动相(轻相)都放在一组特别的分配管中，用来完成这种操作的仪器称为逆流分配仪。(二)分配色谱(DistributionChromatography，DC)离子交换色谱是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的结合力而将其分离。该法适合于离子和在溶剂中发生电离物质的分离。离子交换色谱广泛用于生物大分子分离纯化，特别是在蛋

5、白质、多肽、核酸等生物物质的分离纯化。(三)离子交换色谱(IonExchangeChromatography，IEC)(四)凝胶色谱(GelChromatography，GC)凝胶色谱以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术。凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。凝胶是不带电荷的多孔网状结构的物质，每个凝胶颗粒的细微结构就如一个筛子。混合物随流动相流经凝胶柱时，较大分子不能进入所有的凝胶网孔而受到排阻，与流动相一起首先流出；小分子能进入凝胶网孔，凝胶柱中流出次序靠后。生物体内许多大分子化合物具有与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性(亲和力)。把

6、与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，则当含有目的产物的混合物(流动相)流经此固定相时，即可把目的产物从混合物中分离出来。(五)亲和色谱(AffinityChromatography，AFC)广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。7.1.2.2按固定相形状不同分类(1)柱色谱(2)纸上色谱进样量大，回收容易。除用于分析外，还广泛用于生物样品的制备和工业生物产品的分离与纯化。(3)薄层色谱主要用于分析，也可用于小量样品的制备。7.1.2.3其他分类方法(1)根据流动相的物态分类气相色谱、液相色谱和超临界色谱(2)根据操作压力分类低压色谱(＜0.5MPa)、中压

7、色谱(0.5～5MPa)和高压色谱(5～50MPa)。(3)根据洗脱操作分类根据洗脱时展开方式的不同，可分为洗脱展开法、前沿分析法和置换展开法3种。色谱和电泳是目前最好的两种分离方法，其塔板数可达百万数量级。但电泳法目前尚不能用于生产规模的分离与纯化，因而色谱技术成为分离和纯化蛋白质、酶、核酸、多糖等生物大分子物质的核心手段。根据一次进样量的多少，色谱分离规模可分为：分析色谱：＜10mg半制备色谱：10～50mg制备色谱：0.1～10g工业色谱：＞20g／d7.1.3生物工业中的色谱分离(1