《游技术色谱分离》PPT课件

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1、色谱分离法第一节概述色谱法简介色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或

2、不锈钢管）称为色谱柱。第一节概述色谱分离（ChromatographicResolution，CR）利用多组分混合物中各组分物理化学性质（如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲合力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中。当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离。分离效率高，每米柱长可达几千至几十万的塔板数；应用范围广，从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳定的化合物，尤其

3、是对生物大分子样品的分离，是其他方法无法代替的；选择性强；高灵敏度的在线检测，可采用不同的高灵敏度检测器进行连续的在线检测；快速分离；过程自动化操作。优点1.按分离机理不同分类第二节、色谱分离的分类吸附色谱分离（AdsorptionChromatography，AC）分配色谱（DistributionChromatography，DC）离子交换色谱（IonExchangeChromatography，IEC）凝胶色谱（GelChromatography，GC）亲合色谱（AffinityChromato

4、graphy，AFC）吸附色谱分离是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。新的吸附色谱技术有：疏水作用色谱（HydrophobicInteractionChromatography，HIC）、金属螯合作用色谱（MetalChelationChromatography，MCC）、共价作用色谱（CovalentInteractionChromatography，CIC）等；吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、氧化钛、氢氧化锌凝胶等。无机吸附

5、剂在有机大分子色层分离中的实用例子——丝裂霉素的精制。丝裂霉素的发酵滤液用活性炭吸附，丙酮洗脱，→蒸去丙酮的浓缩水溶液，用氯仿萃取。→氯仿萃取液上氧化铝柱，先用氯仿冲洗，能部分分带，→接着以氯仿－丙酮（3:2）展开，约2小时后，能分出色层，其中蓝→紫色色带为有效成分丝裂霉素C。→将柱推出，切取蓝紫色部分，用10％甲醇－氯仿洗脱，减压蒸干，→在甲醇－苯中结晶，即可得蓝紫色丝裂霉素C结晶。分配色谱是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。根据固定相和流动相的极性与非极性的差别，分配色谱可分为正相

6、色谱和反相色谱。正相色谱（NormalPhaseChromatography，NPC）的固定相为极性，流动相为非极性，当混合物随流动相通过固定相时，极性较强的化合物被保留，极性较弱的化合物先被洗脱下来。反相色谱（ReversedPhaseChromatography，RPC），固定相为非极性，流动相为极性，用于分离非极性或弱极性物质。离子交换色谱是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的亲合力而将它们分离。该法适合于离子和在溶剂

7、中可发生电离的物质的分离。大多数生物大分子都是极性的，都可使其电离，所以离子交换色谱广泛用于生物大分子的分离纯化，特别是在蛋白质、多肽、核酸等生物物质的分离纯化中，离子交换色谱分离占主导地位。碱性水溶性抗生素的分离和分析也常用离子交换色层分离法。例卡那霉素A,B,C可以用强碱性树脂Dowex1×2（OH型），以水作展开剂，进行离子交换色层分离法分离。在0.9×39cm的色层分离柱中（树脂用量25～50mL，粒度200～400目），流速控制在20～30mL/h，卡那霉素B最先流出，接着卡那霉素C，最后卡

8、那霉素A自柱中流出。凝胶色谱以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，又称为分子筛色谱（MolecularSieveChromatography，MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（SizeExclusionChromatography，SEC）。凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。当混合物随流动相流经凝胶柱时，较大的分子不能进入所有的凝胶网孔而受到排阻，它们将与流动相一起