凋亡细胞被巨噬细胞清除机制的分析

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1、硕士学位论文同的磷脂以脂质体的形式整合到红细胞膜上，观察巨噬细胞对整合了不同磷脂信号红细胞的识别和清除；分别竞争性抑制巨噬细胞表面的Ps结合位点和氧化磷脂的结合位点或分别特异性封闭巨噬细胞表面的PSR和CD36受体，观察处理后的巨噬细胞对整合有磷脂的红细胞的识别和清除。一．氧化磷脂和腊质体的制备1．氧化磷脂的制备：将溶解于氯仿的PS(卜Palmitoyl(C16：0)一2-arachidonyl(C20：4)一3-phosphatidylserine)或PC(卜Palmitoyl(C16：0)一2一arachidonyl(C20：4

2、)一3-phosphatidylch01ine)用氮气吹干，加入PBS使磷脂终浓度为5mM，然后与水溶性过氧自由基引发剂AAPH(2，2’一azobis[2-amidinopropane]一dihydrochloride)(50mM)一起于37℃温育4h，最后用氯仿／甲醇(2：1)卒取得到氧化磷脂。磷脂的氧化程度通过测定磷脂氧化形成的过氧化物中共轭二烯在340nm下的光吸收来评价。通过上述方法制备的氧化磷脂中含30％的氧化磷脂，70％的未氧化磷脂，这种氧化与未氧化的混合物称为氧化磷脂(PSOX或PCOX)。2．脂质体的制备：含不同磷

3、脂脂质体的制备采用Fadock等人报道的方法。将溶于氯仿的不同磷脂按不同的比例混合，用氮气吹干，加入PBS(1000nmol总磷脂加入ImlPBS)。将脂质混合物振荡混匀，然后在冰浴中超声3min(输出功率为60W，脉冲时间6秒钟)。用这种方法分别制备含PS(50％PS，50％PC)、PSOX(50％PSOX，50％PC)、PCOX(50％PCOX，50％PC)和含PS+PSOX(25％PS，25％PSOX，50％PC)、PS+PCOX(25％PS，25％PCOX，50％PC)的脂质体。所制备脂质体当天新鲜使用。二．低密度脂蛋白的制

4、备及氧化采用我们以前报导的方法。新鲜人血液购自南方医院血库，EDTA抗凝，低速离心分离血浆。人血浆LDL(P=1．040kg／L—1．063kg／L)采用一次性密度梯度超速离心法制备。LDL的氧化修饰采用我们以前报导的方法，无EDTALDL(19／L)置含5umol／LCu“的PBS中，37"C温育24h，超滤除菌后4"C保存。中文摘要修饰程度鉴定采用硫代巴比妥酚反应物质(TBARS)测定法。三．红细胞的分离、磷脂信号的整合及NEll的处理1．红细胞的分离：健康人外周静脉血取自于自愿供血者，EDTA抗凝，15009离心lO分钟分离红

5、细胞，红细胞用PBS洗3次后，悬浮于含O．1％葡萄糖的PBS，制成20％的红细胞悬液，置于4℃待用。2．NEM处理：红细胞用PBS稀释至0．1％，加入NEM使其终浓度为10洲，置37"C温育30分钟，用PBS洗三次红细胞以除去未结合的NEM，即NEM处理的红细胞。3．磷脂信号的整合：将制备好的红细胞与含不同磷脂信号的脂质体按不同比例混和，置37"C温育30分钟，用PBS洗去未整合的脂质体。四．红细胞PS外翻的测定整合了磷脂信号和经NEM处理的红细胞的PS外翻采用流式细胞仪(美国BECTONDICKINSON公司)测定AnnexinV

6、--FITC阳性细胞百分率。测定试剂盒购自BIOVISION公司(美国)。按照试剂盒的说明进行操作。五．小鼠腹腔巨噬细胞的制备和培养及竞争性抑制或受体封闭处理1．小鼠腹腔巨噬细胞的制备和培养：巨噬细胞的制备采用我们曾经报道的方法。清洁级雄性昆明小鼠(20+29)购自本校实验动物中心。将小鼠拉颈处死，用70％酒精消毒，往腹腔注射无血清RPMI1640培养基(GIBCO)，收集腹腔液，5009离心10分钟，收集细胞，用含10％胎牛血清的1640调整细胞浓度，将细胞接种于48孔板，370c5％CO。培养箱培养2小时，用PBS洗去未贴壁细胞

7、，加入不同处理的红细胞进行结合和吞噬测定。2．竞争性抑制和特异性受体封闭：用PBS洗去未贴壁的巨噬细胞后，分别加入PS脂质体(终浓度为lmM)、Ox—LDL(终浓度为lOOug／m1)、抗PSRIgG或非特异性的IgG(终浓度均为lOOug／m1)、抗CD36IgA或非特异性的IgA(终浓度均为20ug／m1)。置37。C5％C0：培养箱内培养半小时，吸出上清后再加入整合PS和PSox脂质体的红细胞，进行结合与吞噬测定。六．巨噬细胞对整合不同信号红细胞的结合及吞噬测定硕士学位论文．将正常和整合不同信号的红细胞重悬于DMEM培养基，制

8、成0．1％的红细胞悬液，加入培养于48孔培养板的小鼠腹腔巨噬细胞，置于37。C5％C0：培养箱内培养，1小时后用PBS洗三遍去除未结合的红细胞，于倒置显微镜下计数巨噬细胞结合红细胞的百分率(每个样本计数200个巨噬细胞，结合一个以上红