pGEX-6p-1-Ag85A载体的构建表达与口服减毒伤寒杆菌携带Ag85A+DNA疫苗免疫效应的分析

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1、二、口服减毒伤寒杆菌携带A985ADNA疫苗免疫效应的研究1、口服疫苗的制备取出-700C冻存的运载V1Jns．tPA．A985A质粒的减毒伤寒杆菌，用AxyprepPlasmidMiniprepKit从细菌中提取质粒，用限制性内切酶BglII于370C水浴消化质粒，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。取收获的细菌进行10倍的倍比稀释后，将106，107，108倍稀释的菌液各]玟100lxl接种于含有卡那霉素的固体琼脂平板中，计数菌落数。并依据公式推算出所收获细菌悬液中的细菌总数。2、实验动物分组及免疫C57BL／6小鼠，6—8周龄，雌

2、生，随机分成3组：

3、OA985ADNA质粒组；②空质粒对照组；⑧正常对照组。分别将伤寒杆菌菌苗和生理盐水以灌胃方式投给各组小鼠，共免疫三次，每次间隔三周。分别于初次免疫后2w,4w,6w,8w颈椎脱位处死每组3．4只小鼠进行相关检测。3、ELISA法检测血清中A985A特异性抗体滴度眼球采血分离血清，ELISA法检测小鼠血清中A985A特异性抗体，酶标仪于450nm处测量OD值。4、ELISA法检测脾细胞培养上清中IFN吖和IL．4含量无菌取出感染小鼠脾脏，制成细胞悬液并调整脾细胞终浓度为1x107／ml，24孔培养板上加入细胞悬液，500,t／孑L，于37。C培养

4、48h。10009室温离心10min，收集上清，．800C保存，待IFN吖和IL．4检测。用双抗体夹心ELISA法对IFN吖和IL．4的含量进行检测，酶标仪于450nm处检测OD值，应用SoftMaxPr04．3．1LS软件分析，绘制标准品标准曲线，计算细胞因子含量(pg／m1)。5、统计学处理实验数据经SPSS16．0统计分析软件应用方差分析方法进行统计处理，P

5、85A基因序列与GenBank中结核分枝杆菌A985A序列完全相同。2、A985A蛋白的表达SDS--PAGE电泳及Western．blot检测IPTG诱导E．coliBL21蛋白表达，在分子量为58KDa处有A985A融合蛋白的表达，与预期的蛋白分子量一致。3、血清中A985A特异性抗体滴度初次免疫后A985ADNA质粒组小鼠抗A985A抗体略有增高，滴度为1：50；第二次免疫后A985ADNA质粒组小鼠血清中的抗体水平迅速升高，而空质粒对照组小鼠血清中A985A抗体始终为阴性。4、口服免疫后不同时间脾细胞上清中IF．N吖的分泌水平初次免疫后，

6、A985ADNA质粒组小鼠脾细胞培养上清中的IFN—y水平即出现有意义的升高(P<0．01)，至初次免疫后8w，A985ADNA质粒组小鼠IFN-7浓度达到1400pg／ml，与其它两组差异明显(P<0．01)。空质粒对照组和正常对照组小鼠IFN-丫水平也有所增长，但二者之间没有统计学差异(P>0．05)5、口服免疫后不同时间脾细胞上清中IL．4的分泌水平经过三次A985ADNA疫苗口服免疫，A985ADNA质粒组，空质粒对照组和正常对照组三组小鼠脾细胞上清中IL一4水平均未见明显增长，且浓度较低，三组之间无显著差异(P>O．05)讨论A985复

7、合物是一类30。32kDal拘蛋白质家族【71，它是结核分枝杆菌和BCG培养滤液分泌蛋白的主要成分之一，其中分泌型A985A蛋白可作为结核病DNA疫苗的候选目的抗原f91。本实验用减毒沙门氏菌携带保护性抗原A985A真核表达载体经口服途径免疫小鼠，重点观察口服DNA疫苗经肠粘膜摄取后血清中特异性抗体，脾细胞培养上清IFN吖和IL．4的产生情况，结果提示小鼠血清中特异性抗体水平在4初次免疫后即有升高，加强免疫后升高更明显，末次免疫后抗体滴度达到了1：400，这说明口服减毒伤寒杆菌携带的A985ADNA疫苗能有效地诱导小鼠全身性体液免疫应答。脾细胞培

8、养上清IFN．丫分泌水平大幅度升高，且与空质粒对照组和正常对照组相比有显著性差异(P<0．01)，提示口服减毒伤寒杆菌携带的A985ADNA疫苗具有刺激小鼠产生抗结核菌免疫所需的Thl型免疫应答，这与Huygen等报道的肌注A985ADNA疫苗产生的结果一致p1。‰曲e等证明，A985ADNA删I在不同品系小鼠可诱导产生不同类型的免疫应答，其中对C57BL／6d、鼠可以诱导出强烈的细胞免疫和体液免疫应答【19】，而投给人体刺激何种类型的免疫应答尚需做进一步研究。结论1、成功构建了pGEX一6p·1一A985A载体，并表达A985A蛋白，为A985

9、A特异性抗体的检测和单克隆抗体的制备奠定了基础。2、口服减毒伤寒杆菌携带的A985ADNA疫苗后，有效刺激了抗A985A特异性抗体的产生