参与紫云英共生固氮的1个上调表达结瘤素基因asb6的分离与鉴定

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1、万方数据第29卷第2期2010年4月华中农业大学学报JournalofHuazhongAgriculturalUniversityV01．29No．2Apr．2010，169～174参与紫云英共生固氮的1个上调表达结瘤素基因AsB6的分离与鉴定★吴梅丑敏霞李一星陈大松李友国一华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉430070摘要基于接种华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)7653R的紫云英(AstragalussinicusL)感染根与未接种对照根在转录水平上的差异，利用抑制差减杂交技术(suppressionsubtracti

2、vehybridization，SSH)，建立了紫云英结瘤同氮过程中的差异表达cDNA文库，共获得527个有效克隆，其中增强或特异性表达的上调文库中包含341个克隆，抑制表达的下调文库包含186个克隆。对其中的1个上调表达eDNA克隆AsB6利用RACE(rapidamplificationofcDNAends)方法获得了其基因全长序列，利用BLAST在线软件和GenBank，Gen-BankEST和TigrPorcineEST等数据库进行同源序列比较，表明AsB6与苜蓿的8．酮酯酰合成酶及依赖于SAM(S-adenosglmethiomine，S-腺苷蛋氨

3、酸)的羧甲基转移酶具有66％的同源性，同时利用实时荧光定量PCR研究了该基因的时空表达特征。结果显示，接种根瘤菌7653R后，在紫云英感染根和根瘤中该基因的表达量显著增强，且在接种后根瘤形成早期和同氮中晚期表达量相对较高。推测其可能与根瘤菌前期感染和根瘤形成、根瘤代谢功能有关。关键词抑制差减杂交；紫云英；上调基因；p酮酯酰合成酶；共生同氮中图分类号S154．38+l文献标识码A文章编号1000—2421(2010)02—0169—06紫云英(Astragalussinicus)是生长于中国、韩国和日本的一种豆科绿肥，多种植于稻田中，用于提高土壤肥力。华癸中慢

4、生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)可以和紫云英共生固氮，互作形成不定型根瘤。它和紫云英的共生体系是中国特有的优势共生固氮资源。华癸中慢生根瘤菌具有很强的宿主专一性，决定了它和紫云英的共生体系是研究根瘤菌与宿主植物共生固氮机理的好材料，尤其是在研究根瘤菌和宿主植物之间共生固氮信号的传导和相互作用方面，该体系具有重大的研究价值[1—4

5、。但是目前对于紫云英参与共生固氮的功能基因研究报道较少。共生固氮包括早期和晚期2个过程，大量的根瘤菌和植物双方基因参与其中。早期共生基因调控根瘤菌侵染、侵入线形成以及根瘤形成等过程，晚期共生基因调控着类菌体的分化

6、、根瘤固氮及衰老，从而调控共生固氮的全局过程。然而目前大部分研究都集中在共生早期双方的分子对话方面[5。6]，晚期的研究相对较少，人们对于共生固氮晚期分子机理的认识还远远不够。本研究利用SSH技术比较了紫云英感染根和未接种对照根的基因转录情况，建立了其感染根及未接种对照根的差异表达cDNA文库，以期对紫云英参与共生结瘤固氮过程中的功能基因进行系统的鉴定，从而分离获得新的结瘤固氮相关宿主功能基因和更多有用的分子探针。在前期研究中，作者所在实验室报道了紫云英13个根瘤特异性或增强表达的基因[7-8

7、。这些基因所编码的多肽主要包括Usp家族(universalst

8、ressproteinfamily，Usp)类似物、半胱氨酸蛋白家族(cysteineclusterproteins，CCP)同源物和脂类转运蛋白家族(1ipidtransferprotein，LTP)类似物。本文则报道另外1个在紫云英共生固氮过程中的上调表达基因AsB6的克隆鉴定及其表达特征，并结合序列查询及结构域分析讨论了它的功能。收稿日期：2009—03一02；修回日期：2009—1l一12-1(-国家“973”计划课题(2010CBl26502)和华中农业大学人才启动基金(2005XRC026)资助**通讯作者．E-mail：liyougu02001

9、@yahoo．eom．crl吴梅·女，1984年生，硕士研究生．研究方向：根瘤菌共生固氮体系分子机理．E-mail：wumei．nono(鱼yahoo．com．cn万方数据170华中农业大学学报第29卷1材料与方法1．1材料将紫云英种子浸入95％的乙醇5rain，再以5％NaCl0表面消毒5min，无菌水洗涤6～8次，黑暗中于室温下发芽2d。将发芽的种子无菌条件下浅播于灭菌砂钵中，浇灌Fahraeus无氮营养液[9]，按照16h光照／8h暗期于18--．,22℃培养6d后，接种华癸中慢生根瘤菌(M．huakuii)7653R。1．2总RNA提取用Trizol

10、试剂(Invitrogen，CA，USA)提取，具体