大鼠再生肝中表达上调基因的筛选与鉴定[1]

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1、生物化学与生物物理学报ISSN058229879ACTABIOCHIMICAetBIOPHYSICASINICA2001,33(2):191-197CN3121300/Q大鼠再生肝中表达上调基因的筛选与鉴定刘占武赵慕钧3李载平(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海200031)摘要采用新发展的抑制差减杂交技术(suppressionsubtractivehybridization,SSH),在基因组水平筛选再生肝中高表达基因。大鼠肝部分切除后24h的再生肝组织来源的cDNA作为受检者(tester),正常肝组织的cDNA作为驱动者(driver),

2、进行差减杂交,获得一900个克隆的差减杂交库。随后对差减克隆进行了差异筛选,得到50个在再生肝中高表达的强阳性克隆。序列测定和同源比较表明这些克隆代表了37个基因,其中13个与已报道的肝再生相关的基因同源,15个为已知基因但首次发现与肝再生相关,9个为新的基因(EST)已被GenBank收录。制备了标准化RNA点杂交膜,通过对上述部分基因的RNA点杂交分析,不但确认了这些基因在再生肝中表达水平的升高,同时发现它们在肝再生过程中有不同的表达模式。实验结果提示这些基因在肝再生过程中具有重要功能。关键词基因筛选;肝再生;抑制差减杂交[7]肝组织损伤时具有独特的再生能力。手术切除

3、要求。细胞周期相关蛋白质如CDKs、细胞周期蛋年轻大鼠肝的左叶与中叶,静止的肝细胞开始增白(cyclins)均在肝再生过程中发生明显的表达量变殖,并且到达一定重量时肝再生终止。这个70%部[8]化。部分切除后剩余的肝脏需要承担以前完整肝[1]分肝切除手术提供了研究肝再生的理想模型。肝的代谢功能,肝脏代谢相关的基因表达量也升高,如再生的起始和终止的研究,实质上涉及了细胞有丝G6Pase与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)是糖异生分裂如何从G0期进入G1期,以及细胞的可控制过程中的酶,在绝食12h的大鼠肝再生过程中表达增殖机制等重大理论问题,同时对肝脏疾病的治疗量升高5倍[9

4、]。细胞内的骨架成分肌动蛋白(actin)表和修复有实际的应用价值,因此,受到国内外科学达量升高,以满足细胞增殖本身结构上的调整[10]。家的极大关注。发现和研究肝再生相关基因,是揭肝再生过程几乎调动了肝细胞所有基因的活动,然开肝再生之谜的关键所在。而肝再生的机制仍不清楚。1996年Science杂志曾发肝再生过程中,许多生长因子如HGF、EGF、表了细胞因子IL26是肝再生的关键因子一文,发现[2]TGF2α等分别在肝切除12h或24h后其浓度达到将IL26注射进IL26基因缺失的小鼠,能恢复STAT3最高峰,在促进肝细胞增殖过程中起重要作用。而[11]的信号通路和肝细

5、胞的再生。但是,另一个不可[3][4]TGF2β,活化素A(activinA)等在肝再生后期表否认的事实是存在不依赖于IL26分子的肝再生途达量升高,起抑制细胞增殖的作用。许多转录因子在[12]径。肝再生是一个非常复杂的机制,需要进一步肝再生过程中表达量升高,如c2jun,c2fos基因的产克隆和筛选肝再生相关基因和新基因,以期最终了物结合形成异二聚体(即转录因子AP21),负责激活解肝再生的调控机制。[5]许多增殖相关基因的转录。HRS/SRp40是一个剪利用基因差异表达筛选,是克隆新基因的有效接因子,可介导纤连蛋白(fibronectin)的差异剪接,可途径。我国贺福

6、初实验室曾利用mRNA差异显示能在调节肝再生相关基因转录后加工过程中起作法,获得4个新的再生肝相关的基因片段[6]用。核糖体蛋白L7、L10、L13等的表达水平在肝再[13](EST)。我们采用新发展的抑制差减杂交法生过程中也升高,以满足细胞增殖对蛋白质合成的[14](suppressionsubtractivehybridization,SSH)在基因组水平快速寻找差异表达基因,即以大鼠24h收稿日期:2000209219接受日期:2000211208中国科学院生物科学与生物技术研究特别支持课题(财政部专的再生肝组织来源的cDNA作为受检者(tester),项),编号:

7、KJ95T206/KSCX12Y202而从正常肝组织来的cDNA作为驱动者(driver)进3联系人:Tel,021264374430;Fax,021264338357;e2mail,行差减杂交,从而获得了一个900个克隆的差减杂mjzhao@sunm.shcnc.ac.cn192ACTABIOCHIMICAetBIOPHYSICASINICAVol.33,No.2交库。随后对获得的部分克隆进行差异筛选,得到以正常肝组织来源的cDNA(不加接头)作为驱动50个强阳性克隆。对这50个克隆进行序列测定,者,再生肝中与正常肝相同的D