脓毒症大鼠肝组织基因表达变化的研究

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1、脓毒症大鼠肝组织基因表达变化的研宄郑文贺1李玮1林建东2（1福建省人民医院350004）（2福建医大附属第一医院350004）【摘要】目的放用基因芯片技术初步分析脓毒症大鼠肝脏组织细胞基因表达谱的变化。方法健康Wistar大鼠40只，随机分为模型组和假手术组，每组各20只。通过盲肠结扎穿孔术（CLP）制备大鼠脓毒症模型，应用含有22523个大鼠基因cDNA克隆的表达谱基因芯片进行检测，筛选差异表达基因，用计算机软件分析脓毒症大鼠肝脏组织术后24小时的基因表达变化。结果与假手术组比较，井筛选出差异表达基因共285条，占基因芯片总点数的1.26%，其中己知基因180条，93条基因表达上调

2、，87条基因表达下调。涉及到一系列与细胞生长调节相关基因，物质能量代谢相关基因，信号转导、炎症、应激反应相关基因，转录调控及蛋白质翻译、修饰、加工、降解相关基因等相关的基因异常表达。结论脓毒症导致的多脏器功能不全（MODS）是多种基因作用的结果，釆用基因芯片技术全面揭示脓毒症肝脏基因表达的模式，有利于发现新的研宄目标和治疗途径。【关键词】脓毒症肝基因表达基因芯片【中图分类号】R394【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）08-0053-03脓毒症（S印sis）及其所导致的多脏器功能不全（MODS）,在临床上发病率高，病死率高，临床救治棘手，源于其发病机制非常复杂。

3、目前多数认为是过度的炎症反应与代偿性抗炎反应失衡，出现免疫系统功能紊乱的病理生理过程，并与机体多系统、多器官病理牛.理改变密切相关，涉及感染、炎症、免疫、凝血及组织损害等一系列基木问题［1］。国内外已有学者运用基因芯片技术对经CLP或腹腔注射脂多糖制备小鼠脓毒症模型的多个脏器组织的基因差异表达分别进行研究，其结果初步显示了这些组织中部分基因表达的特异性改变，但并未对脓毒症机制和治疗的研究提出新的看法。木实验再次运用基因芯片技术研宄分析脓毒症时肝脏相对应的基因表达谱变化，旨在进一步探讨脓毒症的研究治疗新途径。1材料和方法1.1实验动物及模型制备雄性健康Wistar大鼠40只，体重180

4、—220g,购自上海斯莱克实验动物有限公司。实验前在清洁级环境下饲养2周，常规饲料喂食、正常饮水。按随机数字表法分组：假手术组（n=20只）、模型组（n=20只）。模型组：采用盲肠结扎穿孔术（CLP）方法建立大鼠肠源性脓毒症模型。实验前大鼠禁食过夜，自由饮水，称体重后以氯胺酮（100mg/kg）腹腔麻醉固定，消毒铺巾，沿中下腹正中线切开2cm开腹提出盲肠，7号丝线距盲肠根部lcm处血管弓内结扎盲肠；用9号无菌针头刺穿盲肠3次，使肠内容物流出，避免伤及肠系膜血管，然后将盲肠放冋腹腔，缝合腹部切U。假手术组：不结扎和穿刺盲肠外，其余操作同CLP组。两组术毕皮下注射平衡液5ml/kg以补充

5、术中丢失的体液并抗休克治疗，术后正常饮食、自由饮水。1.2肝组织的留取和处理两组大鼠（n=40只）24h断颈活杀迅速开腹摘取肝脏，置入液氮罐中骤冷保存，温度一70°C,备用。1.3基因芯片杂交及检测分析用一步法总RNA提取试剂（Trizol）抽提液氮中肝组织总RNA。反转录并标记探针，与RatRef-12大鼠表达谱基因芯片（由联合基因技术有限公司制作，每个芯片含有22523个大鼠基因CDNA克隆）杂交过夜，洗片、晾干后扫描，采用ScanArrav4000型激光共聚焦妇描仪以两种不同波长妇描芯片，应用GenePixPro3.0图像处理软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值，以两

6、次芯片两种荧光信号强度结果比值（Ratio值）均>2.0或均<0.5的基因为差异表达基因，前者示模型组的基因表达显著上调，后者示模型组的基因表达显著下调［2］。通过美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库査询基因功能并加以分类。2结果肝脏基因表达谱差异分析：在模型组中共筛选出差异表达基因共285条，占基因芯片总点数的1.26%,其中已知基因180条，93条基因表达上调，87条基因表达下调；未知基因105条，58条基因表达上调，47条基因表达下调。2.2.1脓毒症组肝脏组织出现表达上调的部分已知差异基因（见表1）:表1脓毒症组肝组织出现表达上调的部分已知差异基因2.2脓毒

7、症组肝脏组织出现表达下调的部分已知差异基因（见表2）:表2脓毒症组肝脏组织出现表达下调的部分己知差异基因2.讨论肝脏是营养物质、炎症介质、激素及内毒素的主要代谢器官。在脓毒血症的发生发展中，肝功能障碍往往在肺、肾功能衰竭发生后出现，可以加速肺脏和肾脏等器官的损伤和功能障碍，从而影响整个机体的新陈代谢，增加脓毒症的救治难度和病死率。Roule和Kettlewell发现，脓毒症患者肝功能异常表现为：白蛋白和胆固醇的降低，以及碱性磷酸酶和血清谷草转氨酶的升高［3