5、基因的分离与鉴定

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1、§5基因的分离与鉴定5.1DNA克隆片段的产生与分离5.2重组体DNA分子的构建及导入受体细胞5.3基因克隆的实验方案5.4克隆基因的分离5.5重组体分子的选择和鉴定基因的克隆包含着待研究的目的基因的分离和鉴定两个主要内容在真核生物中，单个基因仅占整个基因组的极其微小的比例。必须经过扩增（amplification）才有可能分离到含有目的基因的DNA片段。因此需要先构建基因文库（genelibrary）或叫DNA文库（DNAlibrary）。DNA文库：来源于染色体DNA基因组，是来自单个基因组的DNA克隆片段汇总，包含基因

2、组中所有DNA序列。cDNA文库：来源于基因组DNA的转录本（mRNA）再反转录成的cDNA拷贝，是单个基因组编码序列的cDNA克隆片段汇总，包含基因组中所有编码序列。应用大肠杆菌作寄主进行外源DNA片段克隆的综合实验方案真核基因克隆的基本步骤5.1DNA克隆片段的产生与分离5.1.1基因组DNA的片段化（1）利用限制酶片段化基因组DNA的一般问题获得外源DNA片段最简单的方法是鸟枪法（shotgunapproach）：利用限制酶消化给体基因组DNA，不经过凝胶电泳分布分离，就直接用来同载体分子作连接反应的克隆方法。此种方法

3、的缺点是：载体上插入的外源片段大小不同，克隆群体庞大，不利于选择带有目的基因的克隆；当目的基因的核苷酸序列中有一个或数个限制酶识别位点时，需要好几个克隆才有可能获得目的基因的全序列。目的基因核苷酸序列越长，需要的克隆就越多；限制片段太大或太小都不利于正常基因文库的构建。解决这些问题的方法有：限制酶局部消化；机械切割法等限制酶酶切片段的随机程度和大小与其识别序列长短有关：4bp：44=256bp;6bp：46=4096bp;8bp：48=65536随机程度高随机程度低（2）基因组DNA的双酶消化策略1978年，有学者提出了利用

4、两种限制酶混合消化基因组DNA的实验策略。应用这种方法可以获得适于克隆的随机片段化的DNA群体。在进行局部的双酶消化后，可产生大部分为10~30kb范围的随机片段，它们之间存在着有效的随机的序列重叠现象。然后通过蔗糖密度梯度离心等方法得到20kb左右的随机的DNA片段群体，适于λ噬菌体载体的克隆能力。这样，经体外重组、包装和转化后，有把握获得足够多的重组体转化子克隆，构建成几乎完美、代表性的基因文库。在双酶消化策略中，可根据情况选择限制酶组合或具有同尾酶特点的单酶切——在克隆组合。5.1.2DNA片段的大小分布构建完整的基因

5、文库（DNA文库）时，并不需要对某种基因或DNA片段作特别的富集处理。但如果要克隆特定大小的含有目的基因的DNA片段时，可在克隆之前先对片段化的给体DNA群体进行按大小的分步分离，则可以显著提高克隆基因的分离频率。5.1.3编码目的基因的克隆片段的富集如果克隆的目的是分离特定的基因，在对该基因的信息有所了解的情况下，可以通过凝胶电泳或蔗糖梯度离心等方法进行富集。但是，被克隆的目的基因的全序列应该在一条DNA片段上，所以，随机片段化的DNA不适于用此方法。举例：Qβ蛋白质（光合作用相关蛋白质）的psbA基因的克隆将纯化的水稻叶

6、绿体DNA（ctDNA）分别用BamHI、EcoRI及HindIII等限制酶局部消化，然后用含有溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳作分步分离；进行Southern印记转移，同32P放射性标记的目的基因探针进行杂交，结果表明，2.2kb的EcoRI片段、3.8kb的BamHI片段等含有psbA基因的编码序列；根据这些结果，将对叶绿体DNA进行再一次的电泳分步分离，把2.2～2.5kb范围的EcoRI片段（含有psbA基因的编码序列）从低熔点胶中分离出来；在体外与pBR322质粒载体连接重组，转化大肠杆菌寄主细胞，构成水稻叶绿体基因组

7、DNA的EcoRI文库；从近200个转化子菌落中得到8个阳性克隆，其中有6个克隆带有2.2kb的插入片段，进一步分析后发现这些插入片段都含有psbA基因的编码序列。5.2重组体DNA分子的构建及导入受体细胞5.2.1外源DNA片段同载体分子的重组外源DNA片段同载体分子的连接需要限制酶与连接酶的作用。进行连接反应时，需要注意以下3点：①实验步骤要尽可能简单易行；②连接形成的“接点”序列，应能被限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；③有些情况下，对转录和转译过程中的密码结构的阅读不不发生干扰。（1）外源DNA片段的定向

8、插入（2）非互补粘性末端DNA分子间连接①应用化学合成的衔接物构建粘性末端进行基因克隆的程序待克隆的DNA片段PstI衔接物T4多核苷酸激酶载体分子T4DNA连接酶转化与扩增克隆的DNA片段②应用BamHI接头构建重组体分子的基本程序BamHI接头分子外源DNA片段重组体质粒（3）最佳连接