第四章、基因的分离与鉴定

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1、微生物基因工程马玉超北京林业大学生物科学与技术学院办公地点：生物楼办公地点：生物楼117117；电话：；电话：6233601662336016；；Email:myc0307@gmail.com授课内容●引言（2学时）●第一章基因克隆的酶学基础（2学时）●第二章基因克隆的载体（3学时）●第三章基因操作的主要技术原理（3学时）●第四章基因的克隆与鉴定（3学时）●第五章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达●第六章转基因植物●第七章转基因动物●第八章基因治疗●第九章蛋白质工程第四章基因的分离与鉴定♣1.DNA克隆片段的产生与分离♣2.重组体DNA分子

2、的构建及导入受体细胞♣3.基因克隆的实验方案互补作用基因克隆、cDNA基因克隆、基因组DNA克隆♣4.克隆基因的分离应用核酸探针、差别杂交或扣除杂交、mRNA差别显示技术、酵母双杂交体系♣5.重组体分子的选择与鉴定参考书目ò《基因工程原理》吴乃虎编著科学出版社2001.ò《BasicBiotechnologyBasicBiotechnology》，EditedbyCRatledgeandBEditedbyC.RatledgeandB.Kristiansen,CambridgeUniversityPress.科学出版社，第二版，影印版。ò

3、《PrinciplesofBiochemistry》,Lehninger,Nelson,Cox,Worthpublishers,secondedition.目的基因的分离与鉴定四个基本的步骤：♣DNA材料的选择，及DNA分子的片段化；♣外源DNA片段与载体分子的体外连接反应；♣重组DNA分子导入寄主细胞的程序；♣获得了重组体分子的转化子克隆的选择和筛选构建基因文库（genelibrary）或叫DNA文库应用大肠杆菌作寄主进行DNA克隆的综合实验方案核酸内切限双链cDNA的直接的化学DNA片段机械切割制酶消化合成合成粘性末端同载体同聚物加

4、尾平末端连接衔接物分子连接连接体外包装进噬菌体导入寄主噬菌体转染质粒转化外壳，噬菌体或细胞柯斯质粒转导选择遗传免疫化学核酸杂交重组4.1DNA4.1DNA克隆片段的产生与分离4.1.1基因组DNA的片段化■产生片段群体要求：♣必须包容整个基因组的全部序列；♣高纯度；♣大小适合基因操作。■产生片段群体方法：♣机械切割（超声波；搅拌器高速搅拌）♣限制性内切酶（单酶、双酶）。412DNA4.1.2DNA片段的大小分布■构建完全基因文库：♣不做特殊处理；或者脉冲电泳■编码目的基因的克隆片段的富集：♣琼脂糖凝胶电泳♣蔗糖梯度离心123456789

5、1234567894.2重组体DNA分子的构建及导入受体细胞4.2.1外源DNA片段同载体分子的重组■考虑因素：♣实验步骤要尽可能简单易行；♣“接点”能被一定的内切酶重新切割；♣对转录和转译过程中密码子的阅读不发生干扰■外源DNA片段定向插入载体分子：■非互补或平末端DNA分子的连接：♣附加衔接物（接头）♣同聚物加尾PstI衔接物CCTGCAGGGGCCGGCCGGACGTCCCCGGCCGGT4多核苷酸激酶HaeIIIATPpCCTGCAGGpCCGGGGACGTCCpGGCCpT4DNAT4DNA连接酶pCCTGCAGGCCGGCC

6、TGCAGGGGACGTCCGGCCGGACGTCCpPstIpGGCCGGCCTGCAACGTCCGGCCGGp附加衔接物HOOHpOHHOp5ˊHO-GATCCCCGGG-OHHOp3ˊHO-GGGCCC-PHOOHHOpT4DNA连接酶ATPHOOHHOOH多核苷酸激酶ATPpOHHOp同聚物加尾4.2重组体DNA分子的构建及导入受体细胞4.2.1外源DNA片段同载体分子的重组■最佳连接反应：♣载体DNA和外源DNA之间的比例；♣DNA的总浓度；低浓度的DNA(20μg/ml)，自连高浓度的DNA(300~400μg/ml)，多连

7、体分子♣连接温度4.2重组体DNA分子的构建及导入受体细胞4.2.2重组体分子导入受体细胞的途径■转化：♣氯钙氯化钙转化；♣电转化；■体外包装的噬菌体的转导：4.3基因克隆的实验方案从生物有机体中克隆某一特定DNA片段(或基因)的实验程序Clarke-Carbon公式：ln(1-P)N=ln(1-f)N，为一个完全基因文库所应包含的重组DNA的转化子克隆数；P，为在重组体群体中出现目的基因序列的几率(一般期望值为99%)；f，为限制片段的平均大小与基因组DNA总量之比例子：从人类基因组DNA(3×106)，克隆β-珠蛋白基因(1.5kb

8、)ln(1-0.99)N==9.2×106ln[1-(1.5/3×106)]不同生物的全基因组文库应具有的理论克隆数和实际克隆数基因组的大小（bp）克隆片段的平均大2×106(细菌)2×107(真菌)3×1