香水柠檬无籽成因和相关基因的分离与鉴定.pdf

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1、博士博士学位论文香水柠檬无籽成因和相关基因的分离与鉴定香水柠檬无籽成因和相关基因的分离与鉴定张树伟张树伟广西大学二○一四年六月 分类号S666.5密级公开UDC博士学位论文香水柠檬无籽成因和相关基因的分离与鉴定张树伟学科专业作物遗传育种指导教师何新华教授论文答辩日期2014年5月18答辩委员会主席胡桂兵教授学位授予日期 广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学

2、位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：□保密，在□不保密。年解密后适用授权。(请在以上相应方框内打“√”)论文作者签名：日期：指导教师签名：作者联系电话：日期电子邮箱： 广西大学

3、博士学位论文香水柠檬无籽成因和相关基因的分离与鉴定香水柠檬无籽成因和相关基因的分离与鉴定摘要香水柠檬(Citruslimon(L.)Burm.F.)属芸香科柑橘属常绿小乔木，果实长圆形，无核，成熟后香气浓郁，一年四季都能开花结果，是优良的栽培品种之一。本研究首先确定香水柠檬与其它柠檬品种间的亲缘关系，并根据柠檬基因组特点设计SSR分子标记引物。主要开展香水柠檬无籽机制的相关研究，从香水柠檬雌雄配子体育性、胚胎发育、授粉亲和性调查其无籽的原因，在此基础上通过转录组测序分析并筛选与无籽相关的候选基因，克隆其中3个基因的全长序列，进行生物信息学分析，采用荧光定量

4、方法分析基因的表达模式，构建植物过量表达载体将这几个基因转入烟草，获得转基因植株为基因功能分析奠定基础。主要研究结果如下：1、采用ISSR和SCoT分子标记对柠檬、莱檬和藜檬共39份资源进行了遗传多样性分析。两种标记扩增条带的多态性相似，聚类分析显示ISSR分子标记和SCoT分子标记都可以将39份资源大致分为柠檬、莱檬和藜檬三个类群，所有广西来源的藜檬种质划分为一组，引进的柠檬种质划分为一组，北京柠檬单独归为一组。在SCoT分子标记中塔希提莱檬与欧美等引进柠檬品种聚在一起，但在ISSR标记中与小莱檬聚在一起，SCoT分子标记可以将里斯本、尤力克、费米耐劳和

5、菲诺区分开，两种分子标记结果均显示香水柠檬与白花柠檬亲缘关系最近。2、采用改良卡宝品红染色压片法观察香水柠檬小孢子母细胞减数分裂，未见染色体桥、落后染色体等异常现象，可以形成正常的四分体，胞质分裂为同时型，成熟的花粉为2–核花粉粒。香水柠檬和白花柠檬均为二倍体，花粉粒形态均为球形，平均每花药的花粉数量相似，两个品种花粉的生活力和萌发率，无显著差异。3、通过石蜡切片技术观察雌配子体发育，胚囊母细胞经减数分裂形成直线排列的四分孢子，其中1个发育成功能大孢子，单核胚囊经第三次有丝分裂形成八核胚囊，在珠孔端2个助细胞和1个卵细胞组成卵器，合点端有3个反足细胞呈品字

6、形排列，中间有1个中央细胞（含两个极核），香水柠檬雌配子体发育属蓼形。4、对香水柠檬和白花柠檬进行人工授粉试验，香水柠檬自交后切片观察未见胚胎发育，可形成无籽果实；白花柠檬自交后果实有籽；以香水柠檬为父本杂交后果实有I 广西大学博士学位论文香水柠檬无籽成因和相关基因的分离与鉴定籽，说明香水柠檬花粉可育；以白花柠檬为父本杂交后胚胎发育正常形成有籽果实，说明香水柠檬胚囊可育；香水柠檬去雄不授粉可得无籽果实，说明香水柠檬具有单性结实能力。5、以香水柠檬为母本进行自交、杂交授粉，采集的雌蕊经固定、苯胺蓝染色后，在荧光显微镜下观察花粉生长情况。结果表明，授粉后2-4

7、h花粉开始萌发，白花柠檬的花粉生长良好48h后到达花柱下部，72-96h到达珠孔并完成双受精；香水柠檬自交后花粉可以萌发并伸入柱头组织，但是伸长至柱头下部出现卷曲、膨大、甚至破裂，很少见花粉管伸长至花柱。说明香水柠檬具有很强的自交不亲和性。6、对香水柠檬自交、杂交和不授粉的柱头/花柱转录组测序后，采用denovo组装到61,224个unigene，平均长度948bp，N50为1457bp，共47,260个注释到Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO数据库。分析3个样品基因的表达差异，在自交样品中有1356个较另外两样品表达上调，其中包括F

8、-box基因CL2009contig1；杂交样品中有757个较另外