《生物化学检测技术》PPT课件

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1、生物检测技术韶关学院生命科学学院易道生Office：英东楼B-301Mp：13927862492,662492Email：yil1001@163.com内容主要由六个模块构成：生物化学检测技术免疫学检测技术细胞学检测技术分子生物学检测技术微生物学检测技术生物检测仪器第一章生物化学检测技术内容第一节电泳技术第二节光谱分析技术第三节生物大分子含量测定第四节色谱分析技术第五节干化学分析技术目标掌握琼脂糖电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和操作要点。掌握可见光和紫外光的分光光度技术的原理和方法。理解各种蛋白质含量测定技术的原理和优缺点。理解各种核酸含量测定技术的原理和优缺点。

2、第一节电泳检测技术电泳：带电质点在电场中移动的现象。1809年由俄国人发现。1937年瑞典科学家Tiselius建立了“移界电泳法”，成功地分离血清蛋白质各成分。50年代，改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物。60年代，找到聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密切相关学科分析中必不可少的手段。电泳槽和大分子分离结果电泳技术分类从实际和实用出发的分类

3、根据分离样品样品的数量和目的分制备和分析电泳根据结合配套的技术分免疫、层析、等电聚焦、转移、双向、脉冲梯度电场、垂直交替凝胶电泳等根据使用电压分常压（＜500）和高压电泳。根据电泳系统pH连续与否分连续和不连续pH电泳根据介质使用与否分自由和区带电泳（滤纸、薄层、凝胶电泳）根据电泳槽的形式分有垂直的、水平的、柱状的、板状的、毛细管的、湿小室及幕状的。毛细管电泳是20世纪80年代研制出的一种新型的区带电泳方法，具有分辨率好、灵敏度高、检测快捷等特点。自由电泳可分为：①显微电泳（也称细胞电泳），是在显微镜下观察细胞或细菌的电泳行为；②移界电泳；③柱电泳；④自由流动幕电泳；⑤等

4、速电泳等。支持物电泳根据支持物的特点又可分为：纸电泳薄层电泳醋酸纤维素薄膜电泳非凝胶性支持物区带电泳(支持物有：淀粉、纤维素粉、玻璃粉、硅胶等)凝胶区带电泳：淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳。9/21/2021南京农业大学生命科学学院119/21/2021南京农业大学生命科学学院12电泳基本原理电泳是不同的物质颗粒在一定的电场强度下，由于所带电荷及颗粒大小形状等不同，因此向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的一种方法。在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形

5、成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度。电泳时，带电颗粒（球形）在介质中受力平衡匀速运动，则有：v=F阻/f=FE/f=E·q/f=E·q/(6π·r·η)v—泳动度F阻—颗粒所受阻力FE—颗粒所受电场力f—摩擦系数由上式可见：泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带电荷以及电场强度有关。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动度与粒子形状有关。E—电场强度q—颗粒所带电荷r—颗粒半径η—介质黏度相对迁移率（Rf）：分离区带的泳动速度可用相对迁移率来表示。测定迁移率时

6、，在电泳结束后要先在指示剂移动的位置（前沿）作一标记（通常是插一根短铜丝），染色后，量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。Rf＝谱带迁移距离/前沿指示剂迁移距离测量迁移率时，应以谱带的中部位置为准，值得注意的是，交联剂的浓度，交联剂和丙烯酰胺的比例，催化剂浓度及聚胶时的温度和时间均对凝胶柱结构有影响，因而会影响迁移率。另外，电泳时电场强度等也会影响带电颗粒迁移速度。为了使试验重复性好，这些因子都应尽可能保持恒定。一、琼脂糖凝胶电泳1、原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛

7、效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。以对于分子量大的样品，如大分子核酸，病毒等，一般采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶的特点：天然琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖(约占80%)及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成