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1、生物化学实验——电泳技术前言1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：1、提高分辨率及灵敏度。2、简化操作，缩短电泳时间。3、扩大应用范围。各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。掌握电泳技术的基本原理。掌握PAGE不连续系统分离血清Pr的原理与技术。掌握酶活性染色法,鉴定过氧化物酶同工酶乳酸脱氢酶同工酶的原理。掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理和技术。学习电泳前沿技术等电聚
2、焦电泳、双向凝胶电泳电泳、毛细管电泳原理及应用。了解电泳相关技术的原理及应用。教学目的凝胶成像技术凝胶印渍转移技术凝胶干燥技术凝胶扫描技术目录1.电泳技术的基本原理2.PAGE不连续系统分离Pr的原理3.醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白4.PAGE分离血清蛋白鉴定乳酸脱氢酶同工酶5.酶活性染色法鉴定过氧化物酶同工酶6.SDS-PAGE测定蛋白质分子量7.等电聚焦电泳8.双向凝胶电泳目录9.高效毛细管电泳(HPCE)10.电泳相关技术（凝胶成像技术、凝胶印渍转移技术、凝胶干燥技术、凝胶扫描技术）11.注意事项12.参考文献1.电泳技
3、术的基本原理电泳：带电粒子在电场中的定向移动。V:泳动速度cm/秒or分d:泳动距离cmt:电泳时间(秒/分)E:电场强度伏特/cm1.电泳技术的基本原理u:泳动率or泳动度(cm/伏·秒or分)U:电压常压(100—500v)高压(500—10000v)仅需几分钟l:支持场的长度(有效长度)1.电泳技术的基本原理影响泳动率u的因素内因：1.净电荷2.质点大小3.质点形状外因：1.V(U/L)2.缓冲液的pH(pH恒定)3.离子强度[I]最适:0.02-0.24.电渗：液体对固体支持物的相对移动1.电泳技术的基本原理电泳类型⑴区带
4、电泳纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、免疫电泳⑵自由界面电泳支持物为溶液，很少用。返回2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethylethylenediamine，简称TEME
5、D)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O3，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2,C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。化学聚合：制小孔胶。过硫酸铵(NH4)2S2O3APS(引发剂)N,N,N’,N’-四甲基乙二胺TEMED(加速剂)2.聚丙烯酰胺凝胶电
6、泳原理NHCH2=CH—CONH2+CH2=CH—CCH2=CH—C—CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2——CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2—CONH2C=OCH2NHNHOOCONH2C=ONHCH2丙烯酰胺N,N’-甲叉（亚甲基）双丙烯酰胺聚丙烯酰胺反应方程式：2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理三种物理效应⑴样品浓缩效应⑵分子筛效应⑶电荷效应2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。①凝胶孔径不连续性②缓冲液离子成份的不连续性③PH的不连续性2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理①凝胶孔径不连续性单体浓度交联
7、度大孔胶:T=3%C=2.0%小孔胶:T=7%C=2.5%2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理①凝胶孔径不连续性凝胶网孔大小:聚合链长度:由Acr浓度交联程度:由Acr与Bis相对比例Bis的浓度低,孔径大,可在聚合前调节单体与Bis的浓度比如:AcrBisT(%)小孔28.0g0.735g7%大孔10.0g2.5g2.5%2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质<10420-301-4×10415-201-5×104-1×10510-151×1055-10>5×1
8、052-5核酸(RNA)<10415–20104–1055-10105-2×1062-2.62.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理②缓冲液离子成份的不连续性大孔胶pH=6.7先行离子：Cl-存在于凝胶层中任何PH值下随后离子：Gly-存在于电极缓冲液中pI=
