生物化学实验电泳技术原理.ppt

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1、电泳原理与技术移动界面电泳(movingboundaryelectrophoresis)区带电泳(zoneelectrophoresis)稳态电泳(steadystateelectrophoresis)其中以区带电泳为目前常用的电泳系统。依据技术原理，电泳可分三种形式:任何电泳技术方法，均是以某种载体或支持介质作为样品中蛋白质的泳动跑道，在一定温度、pH条件下、稳定的静电场中实现对样品中蛋白质的分离，进而进行分析。电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电内渗小等特性。常见凝胶电泳的支持介质

2、：聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel,PAG)由丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成。未交链的单体丙烯酰胺属神经性毒素，并具有致癌作用，实验过程注意尽可能避免中毒。实验过程简单，仪器设备叫贵重，但分辨率很高，重复性强。主要用于蛋白质、酶、小分子核酸等分离分析。琼脂糖凝胶：从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由1，3连接的β-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水-D吡喃半乳糖交替形成。试剂昂贵，方法简单，分辨率较高。主要用于DNA分离分析。淀粉凝胶：1～5%淀粉凝胶作

3、为载体可对一定分子量的蛋白质进行有效分离。成本低，简单。主要用于同工酶等分离分析。一、醋酸纤维薄膜电泳1.操作技术要领：(1).醋酸纤维薄膜前处理(2).点样：点样2～3l；点样量多少直接影响分离效果，控制点样量是试验成功的关键。点样位置合理：距离薄膜一端约2cm样线上平行点样，2～3个样点基本保持在一条线上。商品薄膜在pH8.6巴比妥缓冲液浸泡1h以上。取出后，小块滤纸对折吸取薄膜表面多余的缓冲液，进行点样。(3).醋酸纤维薄膜置于电泳槽样点一端贴阴极盐桥(黑线端)，非点样端置于阳极盐桥(红线)排除气泡压实(确保薄膜与电极接触良好)。

4、(4).电泳：80～100V；35～50min。pH8.6巴比妥缓冲液培养皿醋酸纤维薄膜-+点样线悬空切勿接触(近)滤纸(5).染色薄膜浸泡于氨基黑溶液中5～10min。(6).脱色薄膜浸泡于漂洗液中进行漂洗，至背景为乳白色。(7).薄膜干燥(8).透明薄膜浸泡于透明液中10～30s，及时取出贴于干净玻板上，排气泡。慢加热，逐步烘干。(9).分析薄膜从玻板上取下，进行分析。Alb(清蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白薄膜置于烘箱完全干燥。-+Alb(白蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白各组分构成白蛋白1-

5、酸性糖蛋白；1-抗胰蛋白酶；HP；CP；-巨球蛋白；脂蛋白；转铁蛋白；补体系统；β脂蛋白IgG；IgM；IgA；IgD；IgE正常参考值Alb：57%～68%1：1.0%～5.7%2：4.9%～11.2%β：7%～13%：9.8%～18.2%凝胶成像系统拍照及扫描分析结果2.醋酸纤维薄膜电泳分离人血清蛋白质原理蛋白质名称等电点相对分子量(KD)Alb(白蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白4.645.065.065.126.85～7.36920030090～150156～950-+在pH8.6条件下血清中哪种蛋白质

6、在电场中向阳极移动最快？-------------分子量相同时，带负电荷越多者移动较快；相同等电点时，分子量较小者向异极移动较快。1比2球蛋白分子量小，向阳极移动快！Alb(白蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白-+%57-722-54-96-1212-20polyacrylamidegelelectrophoresis二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)不同蛋白质由于带电性质、分子颗粒大小及形状不同，在聚丙烯酰胺凝胶(PAG)中，向异极泳动速度快慢不同，经过电泳最终被分开。由于蛋白质在凝胶系统分离过程中存在浓缩效应、电荷

7、效应和分子筛效应，因此，PAGE法是分离、分析蛋白质较好的技术方法之一。（一）PAGE技术流程简介2.制胶1.组架3.点样4.电泳5.染色6.脱色7.分析玻板胶条U型玻板封胶分离胶溶液浓缩胶溶液插入梳子+-电极缓冲液电极缓冲液通常采用过硫酸铵或核黄素来引发该过程,以N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(Tetranmethylenediamine,TEMED)为增速剂。该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原过程。其结果是液态转变为逐步胶凝的半固体状态。凝胶形状取决于模具。（二）丙烯酰胺凝胶聚合原理与凝胶结构CH2=CH︱C=O︱N

8、H2CH2=CH︱C=O︱NH2︱CH2︱NH︱C=O︱CH2=CH甲叉双丙烯酰胺+丙烯酰胺胶联单体胶联剂过硫酸铵TEMED聚丙烯酰胺凝胶具备立体的网状结构-CH2-CH-[CH2-CH-]n