《电泳技术》PPT课件

《《电泳技术》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第四章电泳技术目录第一节基本原理第二节电泳的分类第三节  醋酸纤维素薄膜电泳第四节琼脂糖凝胶电泳第五节聚丙烯酰胺凝胶电泳第六节SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象正极负极带负电粒子带正电粒子第一节基本原理迁移率（或泳动度）是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度，可用下列公式计算：Ｕ=υ/E=(d/t)/(V/l)=dl/VtＵ为迁移率（cm2·V-1·min-1）；υ为颗粒泳动速度（cm·s-1）；E为电场强度（V·cm-1）；d为颗粒泳

2、动的距离（cm）；l为滤纸有效长度（cm）；V为实际电压（V）；t为通电时间（s或min）。通过测量d,l,V,t,即可计算出被分离物质的迁移率。1迁移率单位=10-5cm2·V-1·min-1在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的化学特征常数颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则泳动速度慢。迁移率还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，迁移率与颗表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径成反比。影响电泳速度的外界因素1.电场强度2.溶液的pH值3.溶液的离子强度4.电渗现

3、象5.温度的影响6.支持物的影响影响电泳速度的外界因素1.电场强度电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对泳动速度起着十分重要的作用。一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。影响电泳速度的外界因素2．溶液的pH值溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少。影响电泳速度的外界因素3.溶液的离子强度电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降低，原因是带电的离子会吸引相反符号的离子聚集在其周围，相成一个与运动粒子符号相反的离子氛（ionicatmosphere），它

4、使该离子向相反的方向运动，从而降低了该粒子的迁移率。离子的这种阻碍效应是与其浓度和价数相关的。用离子强度来表示，它的数值如下式：式中s表示共有s种离子，Ci和Zi分别代表每种离子的浓度（mol/L）和价数。影响电泳速度的外界因素4.电渗现象一个U形管的底部装上一块素烧瓷板（密封）,管中装入液体，并在两端加入电极通电，就会看到负极的液面上升。因为瓷板带有负电荷，液体相对地带有正电荷，因而向负极移动。这种液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。影响电泳速度的外界因素5.温度的影响电泳过程中由于通

5、电产生焦耳热，热对电泳有很大的影响。温度每升高1℃，迁移率约增加2.4%。为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，或在电泳系统中安装冷却散热装置影响电泳速度的外界因素6.支持物的影响对支持物的要求一般是均匀和吸附力小，否则电场强度不均匀，影响区带的分离，实验结果及扫描图谱无法重复。第二节电泳的分类一、按分离原理分类二、按有无固体支持物分类电泳的分类一、按分离原理分类区带电泳移界电泳等速电泳聚焦电泳四种电泳的分类二、按有无固体支持物分类第三节醋酸纤维素薄膜电泳一、原理以醋酸纤维素薄膜为支持物。二、材料和试

6、剂三、特点特点：１电泳后区带界限清晰；２通电时间较短；３它对各种蛋白质几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；４灵敏度高，样品用量少。５对染料也没有吸附。６它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果。醋酸纤维素膜电泳槽可做各种醋酸纤维素膜电泳、纸电泳及载玻片电泳等。第四节　凝胶电泳琼脂糖、聚丙稀酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。琼脂糖凝胶电泳一般用低浓度的溴化乙锭染色，聚丙稀酰胺凝胶电泳一般用硝酸银染色，以确定DNA在凝胶中的位置。1～10ng的DNA就可以检测出。琼脂糖和聚丙稀酰胺凝胶可以制

7、备成各种形状、大小和孔隙度，并在各种装置中进行电泳。聚丙稀酰胺凝胶的分辨率可以达到1bp。一般在垂直装置下使用。琼脂糖凝胶电泳的分辨率不如聚丙稀酰胺凝胶，但其分离范围较广。一般在水平装置下使用。琼脂糖凝胶电泳主要用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等，为DNA分子及其片段分子量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。影响琼脂糖凝胶在DNA迁移速率的因素DNA分子的大小琼脂糖的浓度DNA的构象所加电压电场方向碱基组成与温度嵌入染料的存在电泳缓冲液的成分DNA分子大小与琼脂糖浓度的关系

8、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系共价闭环cccDNA>直线DNA>开环的双链环状DNA琼脂糖凝胶电泳的基本操作１、配制缓冲液贮备液２、水平型琼脂糖凝胶制备３、样品的制备与点样４、电泳５、染色６、样品回收桥式水平电泳槽用于对DNA、蛋白的鉴定、分离、制备及分子量测定DNA回收电泳槽用于电洗脱回收DNA微型水平电泳槽用于对DNA、蛋白的鉴定、分离、制备及分子量测定1kbDNAladderAnagarosegelwi