《电泳技术复》PPT课件

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1、电泳技术刘松财2011本章的主要内容电泳技术的应用电泳概念电泳分类电泳原理一、概念电泳（Electrophoresis）：在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳。二、电泳分类电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵等。而区带电泳可用各种类型的物质作支持体，其应用比较广泛。区带电泳的分类如下：1．按支持物物理性状不同，可分为：(1)滤纸及其他纤维素膜如乙酸纤维膜、玻璃纤维膜、聚胺纤维膜电泳。(2)粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳

2、。(3)凝胶电泳，如琼脂糖、琼脂、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。(4)丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。2．按支持物的装置形式不同，可分为：(1)平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式。(2)垂直板式电泳。3．按pH的连续性不同，可分为：(1)连续pH电泳：电泳的全部过程中缓冲液pH保持不变。如纸电泳、乙酸纤维膜电泳。(2)非(不)连续pH电泳：缓冲液与支持物之间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、等电聚焦电泳、等速电泳等，能使分离物质的区带更加清晰，并可作ng级微量物质的分离。三、电泳的基本原理电泳(Electrophoresis)是指

3、带电荷的胶体粒子在电场作用下的定向移动现象。氨基酸、多肽、蛋白质和核酸等具有可解离基团，在溶液中能够形成带电荷的离子，不同物质由于带电性质不同，因而在一定电场强度下移动速度不同。不同的带电颗粒在同一电场中的泳动速度不同，常用迁移率或泳动速度表示。迁移率的定义为带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。式中：m为迁移率(厘米/伏特·秒)；v为颗粒的泳动速度(厘米/秒)；E为电场强度(伏特/米)；d为颗粒泳动的距离(厘米)；l为支持物的有效长度(厘米)，即载体与两极溶液交界面间的距离；V为实际电压(伏特)；t为通电时间(秒)。通过测量d、l、V，t便可计算出颗粒

4、的迁移率。带电颗粒在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的量，颗粒大小和形状有关。一般说来，所带净电荷量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，则在电场中的泳动速度愈快，反之则愈慢。泳动速度除了受颗粒本身性质的影响外，还和其它外界因素有关，它们之间的相互关系可用下式表示：由上式可以看出泳动速度与电动电势(Z)、电场强度(E)及介质的介电常数(D)成正比，与溶液的粘度成（Cn）反比。式中C为一个常数，其数值为4～9π，由颗粒大小所决定。在正常情况下进行电泳时，胶体粘度，介电常数及电势梯度都在同一条件下，故胶体分子大小及其所带电荷多少，决定其泳动速度。由于样品中各种蛋白质

5、的分子量不同，等电点不同，所带电荷多少亦不相同，在一定条件下各种蛋白质的泳动速度(迁移率)各异。影响迁移率的因素有如下几个方面：1.样品带电颗粒本身的性质在几个方面影响着它的迁移率(1)电荷：迁移率随着带电颗粒净电荷的增加而增加，电荷量的大小一般由pH决定。(2)大小：对于较大的分子，由于周围介质所引起的摩擦力和静电引力的增加，迁移率下降。(3)形状同样大小，但具有不同形状的分子，如纤维状蛋白质和球状蛋白质，因摩擦力和静电引力的不同，而表现出不同的迁移率。2.电场根据实验的需要，电泳可分为两种，一种是常压电泳，电压在500伏特以下，分离时间较长。另一种

6、是高压电泳，电压为1000伏特以上，电泳时间很短，有时仅需数分钟。常压电泳多用于分离蛋白质等生物大分子物质；高压电泳则多用来分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。欧姆定律表示了电流(A)、电压(V)和电阻(Ω)之间的关系：A＝v/Ω(1)电流迁移率与电流成正比。带电颗粒迁移的距离与通电时间也成正比。电泳时必须保持电流的恒定。(2)电压电压控制着电流，因此迁移率与加在支持介质两端的电位差(端电压)成正比。(3)电阻迁移率与电阻成反比3.缓冲液(1)成分(2)pH溶液的pH值决定带电颗粒解离的程度，亦即决定其所带净电荷的多少。(3)离子强度一般最适的

7、离子强度在0.02～0.2之间4.电渗电泳时，滤纸、醋酸纤维素薄膜等支持物在缓冲液中都带有负电荷，而与这些支持物接触的水溶液则带正电荷(静电吸引)。电泳时，由于滤纸、醋纤膜等固定不动，于是带正电荷的水就流向负极，并携带颗粒也—起向负极移动。由于电渗现象与电泳作用同时存在，当电泳方向与电渗方向—致时，其蛋白迁移的距离等于两者相加之和；若两者方向相反时，则颗粒的泳动距离为电泳的距离减去电渗的距离。凝胶电泳的支持介质：固体支持介质可以分两类：一类是纸、醋酸纤维素薄膜、硅胶、纤维素等。这些介质相对来说是化学惰性的，能将对流减到最小。另一类是淀粉、琼脂糖和聚丙酰

8、胺凝胶。这些凝胶介质不仅能防止对流，扩散最小，而且它们是多孔介质，孔径大小与生物大分子具有相似