《电泳技术刘芸》PPT课件

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1、第七章电泳技术Electrophoresis分析测试中心刘芸1内容提纲纸电泳凝胶电泳等电聚焦电泳双向电泳电泳技术（DIGE）毛细管技术电泳技术概论3132常用电泳技术2一、定义电泳：带电粒子在直流电场中向着与其本身所带电荷电性相反的电极移动的现象。电泳技术：生物样品在电泳过程中因各组分的移动快慢不同而被分离的技术。利用电泳现象进行物质分离的技术。第一节电泳技术概论34二、电泳分析技术发展概况1809年发现电泳现象1937年Tiselius自由界面电泳1948年Wieland滤纸电泳1959年聚丙烯酰胺凝胶电泳198

2、0’s毛细管电泳(capiliaryelectrophoresis)ArneWilhelmKaurinTiselius蒂塞利乌斯(瑞典人)因研究电泳和吸附分析，特别是发现关于血清蛋白的复杂本质而获奖19485三、电泳分析技术的分类1.根据被分离样品的量多少分析电泳制备电泳2.根据电泳电压的高低常压电泳100～500V高压电泳500～10kV6①滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维②凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳③粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳④丝状电泳，如

3、尼龙丝、人造丝电泳3.根据电泳中是否使用支持物自由电泳—不使用支持物，在溶液中进行。区带电泳—使用支持物(1)按支持物的物理性状不同，可分为7(2)按支持物的装置形式不同，可分为平板式电泳垂直板式电泳垂直柱式电泳891011121314连续pH电泳—指电泳过程中pH保持不变，如滤纸电泳、醋纤膜电泳。不连续pH电泳—指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段有不同的pH，如PAGE、IFE。优点：在不同pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的目的。4.根据电泳系统pH是否连续，可分为15四

4、、电泳技术的特点凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析;样品用量极少;设备简单;可在常温进行;操作简便省时;分辨率高.16五、电泳技术应用临床诊断进行血清蛋白、血红蛋白、精蛋白、脂蛋白的分离、鉴定和含量测定以及血清学酶的检验、免疫化学检验等。工业制造用于提纯酶、激素及其它生化产品基础理论研究从分离与分析无机离子到复杂的生物高分子化合物，以及在放射化学和免疫化学中都占有重要的地位；在各类电泳技术中，尤以凝胶电泳在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子等方面分辨力为最高，为生物化学，分子生物学的

5、发展作出了重大贡献。17六、电泳的基本原理悬浮或溶解在电解质溶液中的带电粒子，在电场作用下以不同的速度向着与自身所带电荷极性相反的电极移动。在电泳过程中，带正电荷的粒子向电场的负极方向移动，带负电荷的粒子向电场的正极方向移动。移动的带电粒子受到电场力和周围介质阻力的作用，当二力平衡时，粒子以稳定的速度向电极方向移动。由于电荷、质量等的差异，粒子将会有不同的质/荷比，使其在电场中具有不同的迁移速度。18以蛋白质分子为例:（q：有效电荷，E：场强）F=Eq电场力：F’=6rv（F’：摩擦阻力，v：在介质粘度η中半径

6、为r的颗粒的移动速度）阻力：19VqM=———=————E6rEqv=————6rEq=6rvF=F’迁移率（Mobility)——带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。20七、影响电泳速度的因素1.电场强度（E）E↑→电流↑→热效应→支持介质上的水分蒸发→样品的热变性E↓→电泳速度慢→延长电泳时间→样品扩散→区带模糊不清→分辨率下降常压电泳100～500V1V/cm~10V/cm高压电泳500～10kV20V/cm~200V/cm21溶液的I越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较清晰。I↑→缓冲能力

7、越大→缓冲液所载的分电流增加，而样品所载的电流相应减少→电泳速度减慢2.离子强度（I）（m：离子的摩尔浓度，Z：离子的价数）对于稀溶液：22pH值决定了化合物解离的程度，也决定了物质所带的净电荷。3.缓冲液的pH23氨基酸的两性解离性质及等电点（pI）pH=pI净电荷=0pHpI净电荷为负NH2CHRCOOHNH3+CHRCOOCHRCOONH3++H++OH-+H++OH-(pK´1)(pK´2)等电点(isoelctricpoint)：当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带

8、正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值。24---------------+++++++++——————————+++++++++（液）---------------负极←→正极4.电渗效应电渗（electro-osmosis）——指在电场作用下液体相对于固体支持物的相对移动。255.分子筛在凝胶电泳中，分离蛋白质等物