《流式试剂培训》PPT课件

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1、流式细胞仪原理及试剂销售培训贝克曼库尔特公司生物科学部朱晓春流式细胞仪的基本原理流式细胞术的基本概念流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量流式细胞术的特点极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flowcytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百

2、万个。可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合

3、位点细胞受体散射光信号RightAngleLightDetectorCellComplexitySSCForwardLightDetectorCellSurfaceAreaFSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter）细胞相对大小及其表面积侧向角散射光（SSC,SideScatter）细胞粒度及细胞内相对复杂性LaserFALSSensorFSC信号SSC信号外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）SideScatterForwardScatter流式细胞仪的检测的荧光信号荧光信号使用荧光标记的单克隆

4、抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量FITCPE-Cy5PE荧光信号双色直接染色CD3-FITCCD19-PE数据分析数据显示:直方图(Histogram)二维点图(DotPlot)等高线图(ContourPlot)密度图(Density)三维图（3DPlot）等数据分析单参数直方图分析PI-Fluorescence#Events正常G0/G1期细胞凋亡细胞峰数据分析双参数点图分析荧光素及染料介绍五光十色的荧光素单分子荧光素耦合的复合荧光素分子新型的荧光素样荧光物质—Qdots常用激光和荧光素搭配BlueFITCPEPerCPPerCP

5、-Cy5.5PE-TexasRed(ECD)PE-Cy5PE-Cy7PIEGFPRedAPCAPC-Cy7UVDAPIHoechst常用的标记单克隆抗体的荧光素488nm激光激发：FITC（异硫氰酸荧光素）：荧光强度可受pH的影响，当pH降低时其荧光强度也随之减弱PE（藻红蛋白）PerCP（多甲藻叶绿素蛋白）：光量子产量并不太高，最好应用在检测表达较高的抗原上PerCP-Cy5.5（叶绿素蛋白偶联物）PE-Cy7（藻红蛋白偶联物）PE-Cy5（藻红蛋白偶联物，又称Cy-Chrome）PE-TexasRed（藻红蛋白-德州红偶联物，又称ECD）633nm激光激发

6、：APC（别藻青蛋白）APC-Cy7（别藻青蛋白偶联物）荧光及荧光发生机理简介荧光及荧光素：某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光波长长的光线——即荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素.荧光发生机理：室温下荧光素分子大部分处于“基态”，当荧光素在一定波长（激发波长）的光的照射下吸收光能后（经染色后的细胞在激光束的照射下），荧光染料吸收能量能级跃迁，进入新的状态，称为“激发态”，处于激发态的分子不稳定，它可以通过在10-9－10-7秒的极短时间内以发射一定波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返回到基态。这一过程称为荧光发射，也就是

7、发光。荧光素的激发和发射光谱任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（nm）激发光谱（Excitation，Ex）：是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max发射光谱（Emission）：是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光发射波峰（最大发射波长）：Em-Max荧光素的使用：选择正确的激光器确定所需荧光探测器（PMT）区别488nm520nm异硫氰酸荧光素（FITC）光学系统：滤光片置于荧光探测器前，利用二向色性长通滤片(DL)及带通滤片(BP)可将不同荧光染料发出的相应波长光谱

8、区别开反射光通过光光源二向色性长通滤片