流式课件教学ppt课件

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1、流式细胞术及其应用流式细胞术的基本概念流式细胞术（Flowcytometry,FCM）是借助于荧光标记的抗体对处在快速直线流动状态中的微粒（通常是细胞）进行多参数、快速的定量分析和分选的技术流式细胞仪是一种集激光技术、电子生物技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器研究对象为生物颗粒，如各种细胞、NDA、人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量或分选流式细胞术的特点极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。可同时分

2、析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选流式细胞仪分类：第一类为临床型。特点为：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。如：BDFACSCalibur流式细胞仪分类：第二类为大型机，科研型。其特点为：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数

3、的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用。如BDFACSDiva流式细胞仪分类：第三类为新型流式细胞仪。仪器选用2-4根激光管，可检测多达十三个荧光参数，并且可实现高速分选，速度达到50000个/秒，能满足多种科学研究要求。如BDFACSAria流式细胞仪的结构一般分为6个部分：流动室及液流驱动系统激光光源及光束成形系统光学系统信号检测与分析系统FCM测量数据的存贮、显示和分析细胞分选系统流动室及液流驱动系统流动室（FlowChamber）是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交，流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个长方形孔

4、，供细胞单个流过。流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流还包，使样品流不会脱离液流的轴线方向，保证准确的细胞荧光信息细胞流与鞘液流的驱动一般采用正加压的方法，流速和压力是正相关关系。只要压力恒定，就可得到恒定的鞘液流流速，从而可确保每个细胞流经激光照射区的速度不变流动室及液流驱动系统改变样本的进样速率开关（Low、Median、High)，可提高采样分析的速度。但是，这并不是提高样本流的速度，而是改变了细胞间的距离，样品流变宽，细胞间距离缩短，这样单位时间内流经光照区的细胞数量就增加*注：激光焦点处能量分布为正态分布，中心处能量最高，因此当样本速率选择高速（Hi）时，样品流不同位置的细胞受激

5、光光照能量不一样，从而造成测量误差（如DNA分析时应选Low）真空泵产生压缩空气，通过鞘液压力调节器加在鞘液上，压力调节器由公司设定的，是恒定的，这样鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的激光光源与光束形成系统激光（Laser）是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源激光光束在达到流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为22×66um即短轴稍大于细胞直径的光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布。FCM的光路调节对使用者是封闭的，即安装时由工程师调试完毕，无须使用者作任何调节光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片

6、、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入不同的探测器光学系统在FCM的光学系统中主要光学元件是滤光片（Filter），分为单色器和双色器。单色器主要分为长通滤片（long-passfilter,LP）、短通滤片（short-passfilter,SP）、带通滤片（band-passfilter,BP）。长通滤片：能够使特定波长以上的光通过的滤光片；短通滤片：能够使特定波长以下的光通过的滤光片；带通滤片：允许某一范围的光通过的滤光片；双色器：一种特殊的滤光片，又称双色性反光镜或分光镜，可以通过大于某种波长的而反射掉小于某种波长的光。信号检测与分析系统当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，

7、受激光激发，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号散射光信号：散射光分为前向角散射（forwardscatter,FSC)和侧向角散射（sidescatter,SSC）。散射光不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理参数或称固有参数荧光信号：当激光光束与细胞正交时，产生两种荧光信号。一种是细胞自发荧光；另一种