流式细胞仪培训教学ppt课件

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1、流式细胞术原理和应用张国平生物医学研究院心血管研究中心2009-6-4主要内容流式细胞仪概述流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的应用检测的一般步骤一、流式细胞仪概述流式细胞仪种类BDFACSVantageBD-CaliburEpicsAltraEpicsAltraBeckmanCoulter流式细胞仪的定义流式细胞仪是指，使细胞（或其他粒子）以单个方式依次高速通过激发光束，采集细胞被光照时产生的各种信号，对信号进行处理，并对各参数进行关联分析的一种仪器。利用流式细胞仪通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性物质（表面或

2、胞浆或胞核）的物理、化学特性并通过这些特性对细胞或颗粒进行定量。检测表面标记物检测胞浆标记物检测胞核内标记物检测可溶性蛋白流式细胞术（FLOWCYTOMETRY）流式细胞仪的基本结构前向散射侧向散射流式细胞仪显微镜流动的细胞静止的细胞样本数量大数量少高速分选样本难以再利用细胞群体特征量分布可以揭示细胞内部结构信息特殊的显微镜高速测定细胞，大样本计数检测稀有细胞多参数分析自动化细胞分选流式细胞仪的主要特点二、流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上

3、，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两种信号被光电二极管和光电倍增管接收，之后转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，最后由计算机进行计算处理。仪器基本组成流路流动室鞘液SHEATH样本流SAMPLE单细胞悬液5105-1106个/ml光路光源滤片光电倍增管PMTHV电路放大电路HV及GAIN增益A/D转换统计计算机流路InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流动室流式细胞仪

4、光路图Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(PE)620BPFL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流动室激光配置488nm氩离子激光器633nm氦氖激光器大功率水冷紫外激光器光路-滤片特性长通滤片–允许长于设定波长的光通过短通滤片–允许

5、短于设定波长的光通过带通滤片–允许一定带宽的波长通过当以45o角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光，这种方式的滤片称为二向色性滤片(dichroicfilter)630nmBandPassFilterWhiteLightSource光信号收集光信号分离，导向，各探测通道PMT接收并转化为电信号。二色镜123带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光数据处理FSCSSCFL1FL2FL3对数线性线性线性对数脉冲处理，模数转换光信号电信号记录数据，显示结果

6、（面积，峰高，宽度）颗粒度细胞大小流式细胞仪产生的信号非荧光信号FL1–FITC,GFP…(PMT2)FL2–PE(PMT3)FL3–ECD,PI…(PMT4)FL4–PC5,APC…(PMT5)荧光信号细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。原理488nm空冷激光：FITC、PE、ECD、PC5、PI、7AAD、PerCP、EGFP、EYFP、AO、TO、Fluo3633nm空冷激光：APC、APC-CY

7、7、CY590-4水冷激光：UV（333-364nm）HOECHST33342、DAPI…三、流式细胞仪应用流式细胞仪应用淋巴细胞免疫功能测定干细胞研究细胞增殖与凋亡检测细胞周期及倍体分析细胞活性分析细胞分选……淋巴细胞亚群活化的T淋巴细胞抗原特异性免疫细胞调控性T细胞树突状细胞先天免疫细胞细胞免疫功能测定细胞群CD抗原T细胞CD2CD3CD4CD5CD7CD8CD28CD38B细胞CD10CD19CD20-CD24CD37CD72-CD75髓系细胞CD13CD14CD15-CD17CD33CD34CD35NK细

8、胞CD16CD56CD57CD94血小板CD31CD41CD42aCD42bCD61CD62pCD63激活抗原CD26CD30CD69CD95-CD97粘附分子CD11a-cCD18CD29CD44CD49a-f内皮细胞CD105CD106CD109细胞因子受体CD25CD115CD117CD122CD126CD抗原及其相关细胞群淋巴细胞亚群数量检查项目和意义疾病CD3C