《流式细胞仪分析》PPT课件

《《流式细胞仪分析》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、流式细胞仪分析技术及应用流式细胞术（FCM）——是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。（图1、2、3）2021/9/172检验本科第一节流式细胞仪的分析及分选原理流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成。流式细胞术所具有的分析和分选功能主要涉及光学原理、光电转换原理和测试原理三部分。2021/9/173检验本科一、工作原理㈠基本组成结构1、液流系统：由样本和鞘液组成。样本：待测细胞被制备成单个细胞的悬液后经荧光染料标记

2、的单克隆抗体染色；鞘液：是辅助样本流被正常检测的基质液。作用（图4）2021/9/174检验本科2、光学系统：由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。⑴激光光源：多为气冷式氩离子激光器，其激光束波长为488nm，15mW。⑵分色反光镜：反射较长波长的光，通过较短波长的光。⑶光束成形器：将激光器发射的激光束聚焦成高15μm、宽57μm的椭圆光斑。2021/9/175检验本科⑷透镜组：将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。⑸滤片：长通滤片一允许长于设定波长的光通过；短通滤片一允许短于设定波长的光通过；带通滤片一

3、允许一定带宽波长的光通过，其他波长的光不能通过。⑹光电倍增管：检测荧光和散射光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。（图13）2021/9/176检验本科3、数据处理系统：主要由计算机及其软件组成。2021/9/177检验本科㈡基本工作原理标志了特异性荧光染料的单细胞悬液经喷嘴高速射下，与水平方向的高度聚焦的激光束垂直相交，单个细胞上标记的荧光染料在通过激光光斑时被激发而产生特异性荧光，同时，由于混合细胞群中细胞大小和胞内颗粒的多少会被激发而产生不同的散射光。在入射光束与液柱垂直的方向有荧光检测系统和散射光感受系统，用于收

4、集荧光信号和侧向散射光信号，前向散射光感受器在前向小角探测接受前向光信号。2021/9/178检验本科被接收的光电信号被光电倍增管转换成电压脉冲和积分脉冲，使信号放大，该信号进入计算机系统进行数据转换、储存、分析、处理，按不同的检测设计采用相应软件程序对结果进行综合分析，并以图像和数据显示于荧光屏上。流式细胞仪产生分析的电信号主要是光散射信号和荧光信号，流式细胞仪依据细胞流经光照射区时电压讯号的强弱来分析和分选细胞。（图5）（图10）2021/9/179检验本科二、散射光的测定细胞对光的散射是细胞在未遭受任何破坏情况下固有的特性。

5、2021/9/1710检验本科㈠前向散射光（FS）由激光束前方的FS检测器收集，FS信号的强弱与细胞的体积大小成正比，用于检测细胞或其他粒子物质的表面属性。（图11）（图6）2021/9/1711检验本科㈡侧向散射光（SS）由激光束垂直方向的侧向检测器收集，SS信号的强弱与细胞或其他颗粒的大小。形状及粒度成正比。SS用于检测细胞内部结构属性，可获得有关细胞内超微结构和颗粒性质的参数。（图12）（图7）2021/9/1712检验本科三、荧光测量荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生，每种荧光染料都有特定的激发波长，

6、激发后又会产生特定波长荧光和颜色，通过滤光片，将不同波长的散射光，荧光信号区分并送到不同的光电倍增管，经过一系列信号转换、放大、数字化处理，就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞百分率。2021/9/1713检验本科选择不同的单克隆抗体及荧光染料就可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同特征。流式细胞仪的检测原理中最重要的一点就是检测荧光的特定发射波长。2021/9/1714检验本科㈠光信号测量线性放大器用于测量信号强度变化范围较少或代表生物学线性过程的信号。对数放大器用于测量信号强度变化范围大且光谱信号较复杂的信

7、号。（图13）流式细胞仪中最常用于单抗标记的荧光染料是FITC、PE、ECD或PeCy5。2021/9/1715检验本科㈡荧光补偿（图8）通常用荧光补偿的方法来消除重叠信号，保证检测信号的正确性。2021/9/1716检验本科四、细胞分选原理㈠基本原理当细胞悬液形成液流柱经流动室，通过机械振动使液流柱断裂成一连串均匀的液滴，当实验设计中设定了被分选细胞的特性参数时，此类细胞在形成液滴时会被充电，使其带有正电荷或负电荷，带电荷的液滴在落入电极偏转板的高压静电场，依所带电荷是正或是负而发生向右或向左道偏转，落人指定的收集器中，完成细胞

8、分选的目的。（图14）（图9）2021/9/1717检验本科㈡技术要求1、分选速度：至少5000个/秒，与分选细胞在悬液中的含量有关。2、分选纯度：除与仪器的精密度相关外，还与被分选细胞与其他细胞有无相互重叠相关。2021/9/1718检验本科3、