流式细胞仪分析技术课件.ppt

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1、流式细胞仪分析技术及应用FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。什么是流式细胞术(FCM)？特点:单细胞的流动的活细胞的定量的多参数的高统计学精度的分选细胞第一节流式细胞仪的分析及分选原理第二节数据的显示与分析第三节流式细胞仪分析的技术要求第四节流式细胞术在免疫学检查中应用一工作原理：FCM是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。第一节流式细胞仪的分析及分选原理1、液流系统样品流和鞘流2、光学系统激光、透镜组、光电倍增管等。3、数据处理系统(一）基本组成构InjectorTip荧光信号激光束S

2、heathfluid样品流和鞘流1、液流系统PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser1234Flowcell激光、透镜组、光电倍增等。2、光学系统（二）基本工作原理单细胞流：流动室单细胞照明：激光488nmlaser488nmlaser单细胞检测：信号处理（一）前向散射光(fowordscatter)：FSC信号的强弱与细胞的大小相关（二）侧向散射光（sidescatter)：SSC信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关二散射光的测定FALSSensorLaserForwardAngleLightScatter细胞对光的散色现象与细

3、胞样品制备无关.90DegreeLightScatterFALSSensor90LSSensorLaser细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.前向散色光FSC侧向散色光SSC利用前向角和测向角散射光可以把外周血白细胞分成三群，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。散射光的测定荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长（一）光信号测量线性放大器对数放大器三荧光测量EthidiumPEcis-ParinaricacidTexasRedPE-TRConj.PIFITC600nm300nm500nm700nm400nm457350514610632488CommonLaserLinesDNAExcit

4、ationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm（二）荧光补偿利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”（一）分选的基本原理488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector四细胞分选原理阳性选择MACS-MagneticCellSorting磁珠分离阴性选择1、分选速度：几千个细胞/秒2、分选纯度:99.5%左右3、分选收获率:90-95%4、分选得率（二）分选的技术要求分选纯度是指分离后的样品

5、中该亚群细胞所占的百分比。分选收获率是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。第二节数据的显示和分析一、参数前向散射光FS:反映颗粒的大小侧向散射光SS:细胞内部结构复杂程度荧光FL:细胞被染上荧光部分数量的多少二、数据的显示方式（一）单参数直方图（二）双参数显示（三）三参数显示以分布直方图(distributionhistogram)来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。(一)单参数直方图的显示Single-ParameterHistogramDisplaysX轴表示绿荧光信号

6、(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量.(二)双参数数据的显示Two-ParameterDataDisplays细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图(DotPlot)。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表第二个测量参数。纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,在图中每一个点代表一个细胞1、点图用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。2、二维等高图纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。3、假三维等高图

7、三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。(三)三参数直方图一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate)技术，来分析参数之间的相互关系。（四）流式细胞仪的多参数分析1、Region设置2、设置Gate样品制备：单细胞悬液特定荧光染料的选择：光谱重叠阴性对照的设置:检测标本的重复性质量控制第三节流式细胞仪免疫分析的技术要求细胞碎片细胞团块离心漂洗固定剂一、免疫检测样品制备淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。Ficoll,40kd，高密度，低渗透压，无毒性。（比重为1.017