《流式细胞术培训》PPT课件

《《流式细胞术培训》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、流式细胞术培训讲座生物物理所蛋白质功能研究平台流式组1980.1以前：1421980.1—1990.1:94501990.1—2000.1:33459.2000.1—2005.1:288502005.1—2009.4.15:29495科技文献数量增长的一个简单统计美国国立生物技术信息中心http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PUBMED查询：检索关键词：flowcytometry结果：目录（一）.流式细胞术的功能特点与应用一.流式细胞仪的功能特点二.流式细胞术的应用（二）.流式细胞仪原理简要一.流体动力学聚焦二.荧光光信号检

2、测三.细胞分选四.实例及数据分析（三）.制备和设计流式样本一.样本制备和实验流程二.设计荧光染料组合的几个注意事项（四）.流式细胞术的新发展流式细胞术的功能特点与应用（1）流式细胞仪的定义流式细胞仪是指，使细胞（或其他粒子）以单个方式依次通过探测光束，采集细胞被光照时产生的各种信号，然后对信号进行处理，并能对多个参数进行关联分析的一种仪器。一.流式细胞仪的功能特点（2）流式细胞仪与荧光显微镜类比荧光显微镜流式细胞仪视野,静止,同时单个,流动,依次肉眼/CCDPMT多激发同时多激发(激光)一.流式细胞仪的功能特点多通道（多参数）高通量高灵敏度定

3、量高精确度细胞分选（3）流式细胞仪的功能特点（1）几个著名的实际应用：◇HIV感染与病程动态监测：辅助T淋巴细胞的绝对计数；◇癌症动态及治疗方案：细胞DNA含量和增殖活性；◇器官移植：交叉配型；◇分选人类染色体，建立遗传文库（geneticlibraries）；◇动物育种的性别选择：分选含x或y染色体的精子；◇人类体外受精；◇造血干细胞和其他一大类干细胞各个分化层次鉴别；◇海洋、环境微生物研究，发现未知种属。二.流式细胞术的应用原子0.1nm1nm10nm100nm1μm10μm100μm1mm氨基酸蛋白质病毒支原体细菌红细胞上皮细胞植物细胞

4、电镜光学显微镜人眼极限当前流式细胞仪可测量颗粒大小最小约0.2μm（2）测量对象：颗粒尺度（单细胞悬浮液）（3）可测量的细胞参数细胞膜：表面糖分子、细胞膜流动性和通透性、膜融合和翻转、膜脂质构成、细胞膜及线粒体膜电位等。细胞质：（1）Ca2+、Na+、K+、H+（2）信号网络蛋白、各种抗原、各类酶分子、细胞骨架蛋白、荧光蛋白（3）酶活、蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化修饰等、核酸分析：DNA、RNA含量，DNA合成、降解、断裂，区分核酸单、双链，测量端粒长度、染色质结构、碱基构成。染色单体分选。无需染色：大小，颗粒度，自发荧光，色素，绝对计数等经验

5、性总结：细胞内几乎所有能够被荧光染料标记的成分或某种变化都可以用流式细胞仪进行检测。流式细胞仪原理简要一.流体动力学聚焦流动室流体动力学聚焦流速：10m/s最大40m/s——高通量20,000—200,000cell/S激光聚焦流体动力学聚焦的效果是，位于液流轴线上的细胞被依次排列成一条单细胞的队列，沿着一条极为精确而稳定的轨道运动。二.荧光检测探测光路聚焦（1）空间立体激发结构三轴垂直：高精确度—2%的荧光差别（2）散射光信号的产生前向散射光：大小侧向散射光：颗粒度FL-AFL-HFL-W面积（A）：荧光总量高度（H）：最大荧光强度宽度（W

6、）：细胞直径（3）PMT：光信号到电脉冲信号高灵敏度—50MESF（4）光学镜片（5）各色荧光信号分离二色反光镜123带通滤光片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光多通道（多参数）另一个参数：时间—连续过程的检测多激光激发：多通道（多参数）—6杆激光，17个荧光通道八角反射式信号收集系统（6）更先进的光信号收集和分离方式提高的灵敏度—(二色反光镜)反射~透射:95%~80%二.细胞分选原理●高通量●高纯度：可达99.9%●可分选极少含量的细胞●多种分选方式FACSVantageDiva的模拟四路分选。四.实例与数据分析（1）

7、红细胞裂解后的外周血细胞检测成分：样本中的细胞有单核细胞，淋巴细胞，粒细胞染色：单克隆抗体标记1）CD14存在于单核细胞表面。荧光染料：Phycoerythrin（PE）2）CD45以不同的密度存在于所有白细胞表面。（淋巴细胞>单核细胞>粒细胞）荧光染料：fluoresceinisothiocyanate(FITC).信号收集：FSC，SSC，PE/FITC双荧光信号。细胞数：10，000。二维图：散点图CD45FITC(log)R1=单核细胞(CD14+ve)R2=淋巴细胞(CD45>单核细胞)R3=粒细胞(CD45<单核细胞)CD14PE

8、(log)前向散射光(linear)侧向散射光(linear)CD14PECD45FITC细胞数细胞数CD45FITCCD14PE一维图：直方图对比：双参数的二维图