《流式细胞术》ppt课件

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1、流式细胞术（FlowCytometry,FCM）利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。标本处理免疫荧光标记直接免疫荧光标记间接免疫荧光标记流式细胞术常规检测时的样品制备（一）直接

2、免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上,再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。直接荧光标记法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。(二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬

3、液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。最小化非特异性结合的方法常用的荧光染料（488波长激发）荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC4885

4、25免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红PI488620DNA染色橙红PECy7488755免疫荧光深红7AAD488675区分死细胞其中PE最强，使用于弱表达抗原FITC最便宜，使用于强表达抗原培养细胞制作细胞悬液300-400目滤网过滤免疫荧光标记上机流式细胞术检测培养细胞表面抗原的样品制备方法探讨应用EDTA、胰酶、细胞刮、联用EDTA及细胞刮制备单用EDTA或细胞刮制备的细胞悬液中细胞产量低,胰酶或联用EDTA及细胞刮制备的细胞悬液中细胞产量高(F=26

5、3.63,P＜0.001).胰酶组细胞表面HLA-DR和ICAM-1的荧光强度明显降低,且以HLA-DR抗原下降比例较多(HLA-DR:F=3.77,P=0.022;CD54:F=10.33,P＜0.001).EDTA组、细胞刮组、EDTA联合细胞刮组间HLA-DR和ICAM-1的荧光强度表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论:EDTA联合细胞刮法是贴壁培养细胞制备单细胞悬液的一种好方法操作步骤制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、　　　　　胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓　　　　　　　　　用10％FCSRPMI

6、1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓　　　　　　　　取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓　　　　　　　　　弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓　　　　　　　　

7、　加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，　　　　　　　　　视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)1.DPBS(×10,贮存液)NaCl80gKCl2g蒸馏水加至1000mlNa２HPO４11.5g临用时用蒸馏水1∶10稀释KH２PO４2g2.洗涤液DPBS900mlFCS50ml(终浓度5％)4％NaN３50ml(终浓度0.2％)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g(终浓度2％)甲　醛10mlNaN３0.2g(

8、终浓度0.02％)注意事项1.整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相